Provedení čtyř testů amplifikace nukleové kyseliny k identifikaci SARS-CoV-2 v Etiopii

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer). Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel tří snímků najednou. Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet třemi snímky najednou nebo pomocí tlačítek posuvníku na konci procházet třemi snímky najednou.
Od vypuknutí koronavirového onemocnění (COVID-19) v roce 2019 bylo po celém světě vyvinuto mnoho komerčních testů amplifikace nukleových kyselin (NAAT), které se staly standardními testy. Přestože bylo rychle vyvinuto několik testů a aplikováno na laboratorní diagnostické testy, výkon těchto testů nebyl hodnocen v různých prostředích. Proto se tato studie zaměřovala na vyhodnocení výkonnosti testů Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI a Sansure Biotech pomocí Composite Reference Standard (CRS). Studie byla provedena v Ethiopian Public Health Institute (EPHI) od 1. do 30. prosince 2020. 164 vzorků z nosohltanu bylo extrahováno pomocí mini sady QIAamp RNA a systému pro přípravu vzorků DNA Abbott. Ze 164 vzorků bylo 59,1 % pozitivních a 40,9 % negativních na CRS. Pozitivita Sansure Biotech byla ve srovnání s CRS významně nízká (p < 0,05). Pozitivita Sansure Biotech byla ve srovnání s CRS významně nízká (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Pozitivní výsledky Sansure Biotech byly významně nižší ve srovnání s CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech měl významně méně pozitivních výsledků ve srovnání s CRS (p < 0,05).Celková shoda čtyř analýz byla 96,3–100 % ve srovnání s CRS. Kromě nízké míry pozitivity testu Sansure Biotech byla výkonnost všech čtyř testů téměř srovnatelná. Jako takový vyžaduje test Sansure Biotech [Pouze výzkum (RUO)] další ověření pro jeho použití v Etiopii. Nakonec by měl být zvážen další výzkum pro vyhodnocení testů s příslušnými tvrzeními výrobce.
Laboratorní testování je součástí Strategického plánu připravenosti a reakce na koronavirus (SPRP) Světové zdravotnické organizace (WHO) pro rok 2019 (COVID-19). WHO doporučuje, aby země vybudovaly laboratorní kapacity pro zlepšení připravenosti, řádného řízení případů, ostražitosti a rychlé reakce na výzvy v oblasti veřejného zdraví. To naznačuje, že role laboratoře je klíčová pro charakterizaci onemocnění a epidemiologii nově se objevujících infekčních agens a kontrolu jejich šíření.
Diagnóza COVID-19 vyžaduje epidemiologické a lékařské informace, osobní příznaky/znaky a radiografické a laboratorní údaje2. Od doby, kdy bylo v čínském Wu-chanu hlášeno vypuknutí COVID-19, bylo po celém světě vyvinuto mnoho komerčních testů amplifikace nukleových kyselin (NAAT). Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce v reálném čase (rRT-PCR) se používá jako rutinní a standardní metoda pro laboratorní diagnostiku infekce těžkého akutního respiračního syndromu 2 (SARS-CoV-2)3. Molekulární detekce SARS-CoV-2 je typicky založena na genech N (gen pro nukleokapsidový protein), E (gen pro obalový protein) a RdRp (gen RNA-dependentní RNA polymerázy) v ORF1a/b (otevřený čtecí rámec 1a/b). gen) oblast identifikovaná z virového genomu. Jsou považovány za hlavní konzervované oblasti nalezené ve virových genomech pro rozpoznání virů4. Mezi těmito geny mají geny RdRp a E vysokou analytickou citlivost detekce, zatímco gen N má nízkou analytickou citlivost5.
Výkon PCR testů se může lišit v závislosti na různých faktorech, jako jsou: extrakční činidla, amplifikační/detekční činidla, extrakční metoda, kvalita PCR přístroje a dalších přístrojů. Od dubna 2020 získalo povolení pro nouzové použití (EUA) pro diagnostiku COVID-196 více než 48 různých diagnostických zařízení z devíti zemí. V Etiopii se pro PCR detekci SARS-CoV-2 používá více než 14 platforem PCR v reálném čase ve 26 institucích veřejného zdraví, včetně ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 a Quant-studio7. Kromě toho jsou k dispozici různé testovací sady PCR, jako je Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test a SARS-CoV-2 BGI test. Přestože je rRT-PCR vysoce citlivá, někteří pacienti s COVID-19 hlásí falešně negativní výsledky kvůli nedostatečným kopiím virové ribonukleové kyseliny (RNA) ve vzorcích v důsledku nesprávného odběru, přepravy, skladování a manipulace a laboratorního testování. podmínky a jednání personálu8. Kromě toho může nesprávné zacházení se vzorkem nebo kontrolou, nastavení prahu cyklu (Ct) a zkřížená reaktivita s jinými patogenními nukleovými kyselinami nebo neaktivní/zbytkovou RNA SARS-CoV-2 vést k falešně pozitivním výsledkům v testech rRT-PCR9. Je tedy jasné, že PCR testy skutečně mohou identifikovat nosiče genových fragmentů, protože nedokážou rozlišit ani mezi skutečně aktivními virovými geny, takže testy mohou identifikovat pouze nosiče, nikoli pacienty10. Proto je důležité posuzovat diagnostický výkon pomocí standardních metod v našem prostředí. Ačkoli je mnoho činidel NAAT k dispozici v Ethiopian Public Health Institute (EPHI) a v celé zemi, nebylo dosud hlášeno žádné srovnávací hodnocení jejich účinnosti. Cílem této studie bylo proto vyhodnotit srovnávací výkon komerčně dostupných souprav pro detekci SARS-CoV-2 pomocí rRT-PCR pomocí klinických vzorků.
Do této studie bylo zahrnuto celkem 164 účastníků s podezřením na COVID-19. Většina vzorků byla z léčebných center (118/164 = 72 %), zatímco zbývajících 46 (28 %) účastníků bylo z neléčebných center. Z účastníků neléčených v centru mělo 15 (9,1 %) klinicky suspektní případy a 31 (18,9 %) mělo kontakty na potvrzené případy. Devadesát tři (56,7 %) účastníků byli muži a průměrný (± SD) věk účastníků byl 31,10 (± 11,82) let.
V této studii byla stanovena pozitivní a negativní míra čtyř testů na COVID-19. Pozitivní míry testu Abbott SARS-CoV-2, testu Daan Gene 2019-nCoV, testu SARS-CoV-2 BGI a testu Sansure Biotech 2019-nCoV tedy byly 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % a 55,5 %. Pozitivní a negativní skóre kompozitního referenčního standardu (CRS) bylo 97 (59,1 %) a 67 (40,9 %) (tabulka 1). V této studii byla definice CRS založena na pravidle „jakýkoli pozitivní“, přičemž ze čtyř výsledků testů byly dva nebo více výsledků testů se stejným výsledkem považovány za skutečně pozitivní nebo negativní.
V této studii jsme zjistili negativní procentuální shodu (NPA) 100 % (95% CI 94,6–100) pro všechny analýzy ve srovnání s CRS. Analýza Sansure Biotechnology ukázala minimální PPA 93,8 % (95% CI 87,2-97,1) a analýza Daan Gene 2019-nCoV měla celkovou shodu 99,4 % (95% CI 96,6-99,9). Naproti tomu celková shoda mezi testem SARS-CoV-2 BGI a testem Sansure Biotech 2019-nCoV byla 98,8 % a 96,3 % (tabulka 2).
Cohenův koeficient shody kappa mezi CRS a výsledky testu Abbott SARS-CoV-2 byl plně konzistentní (K = 1,00). Podobně Cohenovy hodnoty kappa detekované Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI a Sansure Biotech 2019-nCoV jsou také plně v souladu s CRS (K ≥ 0,925). V této srovnávací analýze chí-kvadrát test (McNemarův test) ukázal, že výsledky testu Sansure Biotech 2019-nCoV byly významně odlišné od výsledků CRS (p = 0,031) (tabulka 2).
Jak je znázorněno na Obr.1 procento nejnižší hodnoty Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RdRp a N) bylo 87,6 % a hodnota Ct genu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že procento nízké hodnoty Ct (< 20 Ct) (< 20 Ct) a vysoké hodnoty Ct3 bylo 50. 3,2 %. 1 procento nejnižší hodnoty Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RdRp a N) bylo 87,6 % a hodnota Ct genu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že procento nízké hodnoty Ct (< 20 Ct) (< 20 Ct) a vysoké hodnoty Ct3 bylo 50. 3,2 %.Jak je znázorněno na Obr.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинировансствилион) RdR 87,6 %, значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого низкачо низкачо низказало составлял 50,3 %, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2 %. 1, procento analýzy nejnižší hodnoty Ct (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RdRp a N) bylo 87,6 % a hodnota Ct analýzy genu ORF1a/b u Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že vysoké procento nízké hodnoty Ct (< 20,0 Ct) představovalo hodnotu Ct3 a 50,6 % (36–40 Ct) tvořilo 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比 tech，< 20 Ct 值百分比＼亸2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3 %，高Ct–40 Ct (36)的百分比为 3,2 %。 Jak je znázorněno na obrázku 1, nejnižší procento hodnoty Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinace genu RdRp a N) je 87,6 %, hodnota Ct genu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV vykazuje nízké procento Ct值 (< 20 % Ct je 5 % Ct).值 (36–40 Ct) 的 procento je 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp a N) имел саІное низкое значение Ct (< 20 Ct) v rozpětí 87,6 %, значение Ct гена ORF1a/b v исследовании Sansure Biotech 2019- АланиоззАнанио низкий Ct. Jak je znázorněno na obrázku 1, test Abbott SARS-CoV-2 (kombinující geny RdRp a N) měl nejnižší procentuální hodnotu Ct (< 20 Ct) 87,6 %, zatímco hodnota Ct genu ORF1a/b ve studii Sansure Biotech 2019 – Analýza nCoV ukázala nízké Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3 %, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составис 3,2 %. Procento hodnot (< 20 Ct) bylo 50,3 %, procento vysokých hodnot Ct (36–40 Ct) bylo 3,2 %.Test Abbott SARS-CoV-2 B zaznamenal hodnoty Ct nad 30. Na druhé straně v testu BGI SARS-CoV-2 měl gen ORF1a/b vysokou hodnotu Ct (> 36 Ct), procento bylo 4 % (obr. 1). Na druhé straně v testu BGI SARS-CoV-2 měl gen ORF1a/b vysokou hodnotu Ct (> 36 Ct), procento bylo 4 % (obr. 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), трочотонение составлял 4 % (рис. 1). Na druhou stranu při analýze BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b měl vysokou hodnotu Ct (> 36 Ct), jejíž procento bylo 4 % (obr. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比丼分比丼分比丼分比为分比丼分比为 4% Na druhou stranu při detekci BGI SARS-CoV-2 je procento genu ORF1a/b s vysokou hodnotou Ct (>36 Ct) 4 % (obrázek 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b s высокими значенстиями Ct 4% (>36 Ct) (рис. 1). Na druhou stranu v analýze BGI SARS-CoV-2 bylo procento genů ORF1a/b s vysokými hodnotami Ct (>36 Ct) 4 % (obr. 1).
V této studii jsme odebrali 164 vzorků z nosohltanu. U všech typů testů byla izolace a amplifikace RNA provedena pomocí metod a souprav doporučených příslušnými výrobci.
Tato studie prokázala, že Abbottův test na SARS-CoV-2 má stejný detekční výkon jako CRS, se 100% pozitivní, negativní a celkovou shodou. Cohenova dohoda kappa je 1,00, což znamená plnou shodu s CRS. Podobná studie Washingtonské univerzity v USA zjistila, že celková senzitivita a specifičnost Abbottova testu na SARS-CoV-2 byla 93 %, respektive 100 %, ve srovnání s laboratorně stanoveným testem (LDA) CDC. 11. Detekční systém Abbott SARS-CoV-2 je založen na současné kombinované detekci genů N a RdRp, protože oba geny jsou citlivější a minimalizují falešnou negativitu12. Studie ve Vídni v Rakousku také ukázala, že velké objemy extrakčního vzorku a objemy detekčního eluentu minimalizovaly účinky ředění a zvýšily účinnost detekce13. Abbottův dokonalý soulad s testem SARS-CoV-2 tedy může být spojen s platformovým detekčním systémem, který současně detekuje kombinatorické geny, extrahuje velké množství vzorků (0,5 ml) a používá velké množství eluentu (40 µl).
Naše výsledky také ukázaly, že detekční výkon genetického testu Daan byl téměř stejný jako u CRS. To je v souladu se studií14 provedenou na Anhui University v Huainanu v Číně a tvrzením výrobce o 100% pozitivní shodě. Navzdory zprávám o konzistentních výsledcích byl jeden vzorek po opětovném testování stejného eluátu falešně negativní, ale byl pozitivní v testech Abbott SARS-CoV-2 a Sansure Biotech nCoV-2019. To naznačuje, že může existovat variabilita výsledků napříč různými typy testů. Nicméně ve studii provedené v Číně15 byl výsledek testu Daan Gene významně odlišný (p < 0,05) ve srovnání s jejich laboratorním referenčním testem. Nicméně ve studii provedené v Číně15 byl výsledek testu Daan Gene významně odlišný (p < 0,05) ve srovnání s jejich laboratorním referenčním testem. Тем не менее, v исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значиотелче 0,05) od toho лабораторного эталонного анализа. Ve studii v Číně15 se však výsledky analýzy Daan Gene významně lišily (p < 0,05) od jejich laboratorní referenční analýzy.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan зната отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Ve studii v Číně15 se však výsledky Daanova genetického testu významně lišily (p < 0,05) ve srovnání s jeho referenčním laboratorním testem.Tato nesrovnalost může být způsobena citlivostí referenčního testu k detekci SARS-CoV-2 a pro určení příčiny mohou být důležité další studie.
Kromě toho naše studie hodnotila srovnávací výkon testu SARS-CoV-2 BGI s CRS, přičemž prokázala vynikající pozitivní procentuální shodu (PPA = 97,9 %), negativní procentuální shodu (NPA = 100 %) a celkovou procentuální shodu podle pohlaví (OPA). ). = 98,8 %). Cohenovy hodnoty Kappa vykazovaly dobrou shodu (K = 0,975). Studie v Nizozemsku16 a Číně15 prokázaly konzistentní výsledky. Test SARS-CoV-2 BGI je jednogenový (ORF1a/b) detekční test využívající 10 µl amplifikačního/detekčního eluátu. Přes dobrou statistickou shodu s našimi referenčními výsledky analýza vynechala dva pozitivní vzorky (1,22 %) z celkového vzorku. To může mít obrovské klinické důsledky pro dynamiku přenosu jak na úrovni pacienta, tak na úrovni komunity.
Další srovnávací analýzou zahrnutou v této studii byl test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); celkové procento shody bylo 96,3 %. Síla shody byla také určena hodnotou Cohen's Kappa, která byla 0,925, což ukazuje na plnou shodu s CRS. Naše výsledky jsou opět totožné se studiemi provedenými na Central South University v Changsha v Číně a na oddělení klinické laboratoře Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, Čína17. I když byla zaznamenána výše uvedená dobrá statistická shoda, chí-kvadrát test (MacNemar test) ukázal, že výsledek testu Sansure Biotech měl statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p < 0,005). I když byla zaznamenána výše uvedená dobrá statistická shoda, chí-kvadrát test (MacNemar test) ukázal, že výsledek testu Sansure Biotech měl statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическотретиответ хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеетачтатистиозенский различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Přestože byla zaznamenána dobrá statistická shoda výše, chí-kvadrát test (McNemarův test) ukázal, že výsledek testu Sansure Biotech měl statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验，但卡方检验（MacNemar 检验）表明擣绚表明擣绚Sansure明擣绚相比具有统计学显着差异＂(p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ［ biotech 朣与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。〉） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат ( Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech a C Přes dobrou statistickou shodu uvedenou výše ukázal chí-kvadrát test (McNemarův test) statisticky významný rozdíl (p < 0,005) mezi testem Sansure Biotech a CRS.Bylo zjištěno, že šest vzorků (3,66 %) bylo falešně negativních ve srovnání s CRS (doplňková tabulka 1); to je velmi důležité, zejména s ohledem na dynamiku přenosu viru. Výše uvedená data také podporují tuto nízkou míru detekce15.
V této studii byly hodnoty Ct stanoveny pro každý test a příslušnou platformu, přičemž nejnižší průměrná hodnota Ct byla hlášena v testu Abbott SARS-CoV-2. Tento výsledek může souviset se simultánním kombinovaným genetickým testovacím systémem společnosti Abbott pro detekci SARS-CoV-2. Proto podle obrázku 1 mělo 87,6 % výsledků Abbott SARS-CoV-2 hodnoty Ct pod 20. Pouze malý počet výsledků vzorků (12,4 %) byl v rozmezí 20-30. Hodnoty Ct nad 30 nebyly zaznamenány. Kromě toho, že společnost Abbott použila formát panelu genetického testování SARS-CoV-2, může tento výsledek souviset se spodním limitem detekce (32,5 kopií RNA/ml)18, který je třikrát nižší než spodní limit společnosti 100 kopií RNA/ml. ml)19.
Tato studie má určitá omezení: za prvé nemáme standardní/referenční metody [jako je virová zátěž nebo jiné laboratorní testy (LDA)] kvůli nedostatku zdrojů. Za druhé, všechny vzorky použité v této studii byly výtěry z nosohltanu, zatímco výsledky nebyly použitelné na jiné typy vzorků, a za třetí, velikost našeho vzorku byla malá.
Tato studie porovnávala účinnost čtyř testů rRT-PCR pro SARS-CoV-2 pomocí vzorků z nosohltanu. Všechny detekční testy měly téměř srovnatelný výkon, s výjimkou testu Sansure Biotech. Kromě toho byla zjištěna nízká míra pozitivity v testu Sansure Biotech ve srovnání s CRS (p < 0,05). Kromě toho byla zjištěna nízká míra pozitivity v testu Sansure Biotech ve srovnání s CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результосRSиве презультостов 0,05). Navíc test Sansure Biotech ukázal nízké procento pozitivních výsledků ve srovnání s CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов поно 0,05). Navíc test Sansure Biotech měl nižší míru pozitivity ve srovnání s CRS (p < 0,05).Analýza Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) PPA, NPA a celkové shody přesáhla 93,5 % s hodnotou shody Cohen Kappa 0,925. A konečně, Sansure Biotech Assay (RUO) potřebuje další validaci pro použití v Etiopii a měl by být zvážen další výzkum pro hodnocení tvrzení jednotlivých výrobců.
Návrh srovnávací studie byl proveden ve čtyřech zdravotnických zařízeních v Addis Abebě, v nemocnici Eka Kotebe, v léčebném centru Millenium Church, v nemocnici Zewooditu Memorial Hospital a ve specializované nemocnici na tuberkulózu svatého Petra. Data byla sbírána v období od 1. do 31. prosince 2020. Zdravotnická zařízení pro tuto studii byla záměrně vybrána na základě vysokého počtu případů a dostupnosti velkých léčebných center ve městě. Podobně byly podle doporučení výrobců reagencií NAAT vybrány přístroje včetně přístrojů ABI 7500 a Abbott m2000 real-time PCR a pro tuto studii byly vybrány čtyři PCR detekční soupravy, protože většina laboratoří v Etiopii používala minimálně čtyři z nich. Genový test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test a SARS-CoV-2 BGI test provedené během studie).
Testování na SARS-CoV-2 bylo prováděno od 1. do 30. prosince 2020 pomocí 3 ml virového transportního média (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Čína) od jedinců vyšetřovaných na COVID-19 podle EPHI. Vzorky z nosohltanu byly odebrány vyškolenými sběrateli vzorků a odeslány do EPHI v trojitých baleních. Před izolací nukleové kyseliny je každému vzorku přiděleno jedinečné identifikační číslo. Extrakce se provádí z každého vzorku ihned po příjezdu pomocí manuálních a automatických extrakčních metod. Pro automatickou extrakci Abbott m2000 se tedy z každého vzorku extrahovalo 1,3 ml (včetně 0,8 ml mrtvého objemu a 0,5 ml extrakčního vstupního objemu) vzorku a nechalo projít Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Dávka 96 [92 vzorků, dvě detekční kontroly a dvě kontroly bez šablony (NTC)] byla zahrnuta do celkového procesu (vyhledání a detekce) dvou kol SARS-CoV-2 (EUA) v reálném čase. hornictví. Podobně pro ruční extrakci použijte stejné vzorky (pro automatickou extrakci a objev). V průběhu procesu tedy bylo 140 ul vzorků rozděleno na alikvoty a extrahováno pomocí sady QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Německo) v dávkách po 24 (včetně 20 vzorků, dvou kontrol testu a dvou NTC) během devíti kol. Manuálně extrahované eluáty byly amplifikovány a detekovány pomocí tepelného cykléru ABI 7500 pomocí testu SARS-CoV-2 BGI, testu Daan Gene a testu Sansure Biotech.
Automatická izolace a purifikace SARS-CoV-2 virové RNA se řídí principem magnetických kuliček s použitím Abbott DNA reagencií pro přípravu vzorků. Inaktivace vzorků a solubilizace virových částic se provádí pomocí detergentu obsahujícího guanidin isothiokyanát k denaturaci proteinu a inaktivaci RNázy. RNA je pak oddělena od proteinu separací na pevné fázi pomocí oxidu křemičitého, tj. guanidiniová sůl a alkalické pH lyzačního pufru podporuje vazbu nukleových kyselin na oxid křemičitý (SiO2). Krok oplachování odstraní zbývající proteiny a nečistoty, aby se vytvořil čirý roztok. Transparentní RNA je izolována z mikročástic na bázi oxidu křemičitého pomocí magnetického pole přístroje20,21. Na druhé straně manuální izolace a purifikace RNA se provádí metodou spinové kolony s použitím centrifugace namísto magnetického stojanu a separace mikročástic z eluentu.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) byl proveden podle pokynů výrobce, který obdržel EUA19,22 od WHO a FDA. V tomto protokolu byla inaktivace vzorku před extrakcí provedena ve vodní lázni při 56 °C po dobu 30 minut. Po inaktivaci viru byla provedena extrakce nukleové kyseliny na přístroji Abbott m2000 SP z 0,5 ml VTM za použití systému pro přípravu vzorků DNA Abbott m2000. podle výrobce. Amplifikace a detekce byly provedeny pomocí přístroje Abbott m2000 RT-PCR a duální detekce byla provedena pro RdRp a N geny. ROX) a VIC P (proprietary dye) pro cílení a detekci vnitřních kontrol, umožňující současnou detekci obou amplifikačních produktů 19 .
Metoda amplifikační detekce této soupravy je založena na technologii jednokrokové RT-PCR. Geny ORF1a/b a N byly vybrány jako konzervované oblasti pomocí technologie Daan Gene Technology pro detekci amplifikace cílové oblasti. Pro detekci SARS-CoV-2 RNA ve vzorcích byly navrženy specifické primery a fluorescenční sondy (sondy pro N gen značené FAM, sondy ORF1a/b značené VIC). Konečný eluent a hlavní směsi byly připraveny přidáním 5 ul eluentu do 20 ul hlavní směsi na konečný objem 25 ul. Amplifikace a detekce byly prováděny současně na přístroji ABI 750024 real-time PCR.
Geny ORF1a/b a N byly detekovány pomocí diagnostického kitu Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (detekce fluorescenční PCR). Připravte specifické sondy pro každý cílový gen výběrem kanálu FAM pro oblast ORF1a/b a kanálu ROX pro gen N. K této testovací soupravě se eluent a činidla master mix přidají následovně: připravte 30 µl činidla master mix a 20 µl eluovaného vzorku pro detekci/amplifikaci. Pro amplifikaci/detekci byla použita PCR v reálném čase ABI 750025.
Test SARS-CoV-2 BGI je fluorescenční souprava rRT-PCR v reálném čase pro diagnostiku COVID-19. Cílová oblast se nachází v oblasti ORF1a/b genomu SARS-CoV-2, což je metoda detekce jediného genu. Kromě toho je lidský provozní gen β-aktin vnitřně regulovaný cílový gen. Master mix se připraví smícháním 20 µl činidla master mix a 10 µl extrahovaného vzorku RNA v jamkové destičce26. Pro amplifikaci a detekci byl použit fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase ABI 7500. Veškerá amplifikace nukleové kyseliny, podmínky běhu PCR pro každý test a interpretace výsledků byly provedeny podle pokynů příslušného výrobce (tabulka 3).
V této srovnávací analýze jsme pro stanovení procenta shody (pozitivní, negativní a celkové) a dalších srovnávacích parametrů pro čtyři analýzy nepoužili metodu referenčního standardu. Každé srovnání testu bylo provedeno s CRS, v této studii byl CRS stanoven pravidlem „jakýkoli pozitivní“ a výsledek byl stanoven, nikoli jedním testem, použili jsme alespoň dva shodné výsledky testu. Navíc v případě přenosu COVID-19 jsou falešně negativní výsledky nebezpečnější než falešně pozitivní výsledky. Proto, abychom co nejpřesněji řekli „pozitivní“ z výsledku CRS, musí být alespoň dva testy pozitivní, což znamená, že alespoň jeden pozitivní výsledek bude pravděpodobně pocházet z testu EUA. Ze čtyř výsledků testů jsou tedy dva nebo více výsledků testů, které dávají stejný výsledek, považovány za skutečně pozitivní nebo negativní18,27.
Data byla sbírána pomocí strukturovaných formulářů pro extrakci dat, zadávání dat a analýza byla prováděna pomocí statistického softwaru Excel a SPSS verze 23.0 pro popisnou statistiku. Byla analyzována pozitivní, negativní a celková procentuální shoda a ke stanovení stupně shody každé metody s CRS bylo použito skóre Kappa. Hodnoty kappa jsou interpretovány následovně: 0,01 až 0,20 pro mírnou shodu, 0,21 až 0,40 pro obecnou shodu, 0,41-0,60 pro střední souhlas, 0,61-0,80 pro velkou shodu a 0,81-0,99 pro úplnou shodu28.
Etická atestace byla získána z University of Addis Abeba a všechny experimentální protokoly pro tuto studii byly schváleny etiopským vědeckým výborem pro hodnocení etiky institutu veřejného zdraví. Referenční číslo Etické licence EPHI je EPHI/IRB-279-2020. Všechny metody byly aplikovány v souladu s doporučeními a ustanoveními etiopských národních komplexních pokynů pro léčbu COVID-19. Kromě toho byl od všech účastníků studie před účastí ve studii získán písemný informovaný souhlas.
Všechna data získaná nebo analyzovaná v této studii jsou zahrnuta v tomto publikovaném článku. Údaje podporující výsledky této studie jsou k dispozici od příslušného autora na základě přiměřené žádosti.
Světová zdravotnická organizace. Doporučení pro strategie laboratorního testování pro COVID-19: prozatímní pokyny, 21. března 2020 č. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Inteligentní diagnostika COVID-19 na oddělení urgentního příjmu: Vše v praxi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Inteligentní diagnostika COVID-19 na oddělení urgentního příjmu: Vše v praxi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gurgulianis, KI Inteligentní diagnostika COVID-19 na pohotovosti: vše v praxi.Muliou DS, Pantazopoulos I. a Gurgulyanis KI Inteligentní diagnostika COVID-19 na pohotovostních odděleních: end-to-end integrace v praxi. Expert Reverend Respire. lék. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL & St George, K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL a St. George, K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL a St. George K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
SZO. Laboratorní detekce koronavirového onemocnění 2019 (COVID-19) u podezření na onemocnění člověka. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (vstup 15. srpna 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. a kol. Diagnostika COVID-19: Nemoci a testovací nástroje. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. a kol. Založení College of Patologists of Eastern, Central and Southern Africa – Regional School of Pathology of Middle East and South Africa. Afrika. J. Lab. lék. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopský institut veřejného zdraví, federální ministerstvo zdravotnictví. Prozatímní národní strategie a pokyny pro laboratorní diagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (přístup 12. srpna 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falešně negativní testy na výzvy a důsledky infekce SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falešně negativní testy na výzvy a důsledky infekce SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falešně negativní testy na infekce SARS-CoV-2 a jejich důsledky.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falešně negativní testy na provokaci a dopad infekce SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicína. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: strategie respirační prevence a managementu, očkování a další perspektivy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: strategie respirační prevence a managementu, očkování a další perspektivy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные a ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторнафикика стратегии лечения, вакцинация a дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: strategie respirační prevence a léčby, očkování a cesta vpřed.Muliu, DS a Gurgulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: strategie respirační prevence a léčby, očkování a cesta vpřed. Expert Reverend Respire. lék. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidět strom, ale ztratit les. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidět strom, ale ztratit les.Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovostním oddělení: Podívejte se na strom, ztraťte les.Muliou DS, Ioannis P. a Konstantinos G. Diagnóza COVID-19 v pohotovostních místnostech: Les není dost pro stromy. Objevte se. lék. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. a kol. Validace a validace analytické a klinické výkonnosti testu Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatunyan, B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Srovnání 5 různých genetických oblastí COVID-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. a Aflatunyan B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR.Írán. J. Mikrobiologie. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. a kol. Předběžné výsledky národního programu externího hodnocení kvality pro detekci sekvencí genomu SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. a kol. Analytické hodnocení účinnosti pěti souprav RT-PCR pro koronavirus těžkého akutního respiračního syndromu 2. J. Klinické. laboratoř. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. a kol. Hodnocení sedmi komerčně dostupných souprav pro detekci SARS-CoV-2 RNA v Číně založených na polymerázové řetězové reakci v reálném čase (PCR). klinický. Chemikálie. laboratoř. lék. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB a kol. Srovnání sedmi komerčních RT-PCR diagnostických souprav COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu a kol. Porovnání diagnostického výkonu dvou PCR kitů pro detekci SARS-CoV-2 nukleových kyselin. J. Clinical. laboratoř. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR atd. Srovnávací studie čtyř platforem pro amplifikaci nukleové kyseliny SARS-CoV-2 (NAAT) ukázala, že výkon ID NOW byl významně snížen v závislosti na pacientovi a typu vzorku. diagnóza. mikrobiologie. Infikovat. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbottova molekula. Příbalový leták Abbott pro analýzu SARS-CoV-2 v reálném čase. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (K 10. srpnu 2020) (2020).
Klein, S. a kol. Izolace SARS-CoV-2 RNA pomocí magnetických kuliček pro rychlou detekci ve velkém měřítku pomocí RT-qPCR a RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).