Provedení čtyř testů amplifikace nukleových kyselin k identifikaci SARS-CoV-2 v Etiopii

Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v prohlížeči Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Abychom zajistili neustálou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel se třemi snímky najednou. Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet tři snímky najednou nebo pomocí posuvníků na konci můžete procházet tři snímky najednou.
Od vypuknutí koronavirového onemocnění (COVID-19) v roce 2019 bylo po celém světě vyvinuto mnoho komerčních testů amplifikace nukleových kyselin (NAAT), které se staly standardními testy. Přestože bylo několik testů rychle vyvinuto a aplikováno na laboratorní diagnostické testy, jejich výkonnost nebyla dosud hodnocena v různých prostředích. Cílem této studie bylo proto vyhodnotit výkonnost testů Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI a Sansure Biotech s použitím kompozitního referenčního standardu (CRS). Studie byla provedena v Etiopském institutu veřejného zdraví (EPHI) od 1. do 30. prosince 2020. Pomocí mini soupravy QIAamp RNA a systému pro přípravu vzorků Abbott DNA bylo extrahováno 164 vzorků nosohltanu. Ze 164 vzorků bylo 59,1 % pozitivních a 40,9 % negativních na CRS. Pozitivita testu Sansure Biotech byla ve srovnání s CRS významně nízká (p < 0,05). Pozitivita testu Sansure Biotech byla ve srovnání s CRS významně nízká (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Pozitivní výsledky společnosti Sansure Biotech byly ve srovnání s CRS významně nižší (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Společnost Sansure Biotech měla ve srovnání s CRS významně méně pozitivních výsledků (p < 0,05).Celková shoda čtyř analýz byla 96,3–100 % ve srovnání s CRS. Kromě nízké míry pozitivity testu Sansure Biotech byla výkonnost všech čtyř testů téměř srovnatelná. Test Sansure Biotech [pouze pro výzkum (RUO)] proto vyžaduje pro své použití v Etiopii další validaci. V neposlední řadě je třeba zvážit další výzkum, aby se testy vyhodnotily s ohledem na příslušná tvrzení výrobce.
Laboratorní testování je součástí Strategického plánu Světové zdravotnické organizace (WHO) pro připravenost a reakci na koronavirus (COVID-19) z roku 2019 (SPRP). WHO doporučuje, aby země vybudovaly laboratorní kapacity ke zlepšení připravenosti, řádného řízení případů, bdělosti a rychlé reakce na výzvy v oblasti veřejného zdraví. To naznačuje, že role laboratoře je klíčová pro charakterizaci onemocnění a epidemiologie nově vznikajících infekčních agens a kontrolu jejich šíření.
Diagnóza COVID-19 vyžaduje epidemiologické a lékařské informace, osobní příznaky/znaky a radiografické a laboratorní údaje2. Od hlášení ohniska COVID-19 ve Wu-chanu v Číně bylo po celém světě vyvinuto mnoho komerčních testů amplifikace nukleových kyselin (NAAT). Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce v reálném čase (rRT-PCR) se používá jako rutinní a standardní metoda pro laboratorní diagnostiku infekce závažným akutním respiračním syndromem 2 (SARS-CoV-2)3. Molekulární detekce SARS-CoV-2 je typicky založena na genech N (gen nukleokapsidového proteinu), E (gen obalového proteinu) a RdRp (gen RNA-dependentní RNA polymerázy) v oblasti ORF1a/b (gen otevřeného čtecího rámce 1a/b) identifikované z virového genomu. Jsou považovány za hlavní konzervované oblasti nalezené ve virových genomech pro rozpoznávání virů4. Mezi těmito geny mají geny RdRp a E vysokou analytickou citlivost detekce, zatímco gen N má nízkou analytickou citlivost5.
Výkonnost PCR testů se může lišit v závislosti na různých faktorech, jako jsou: extrakční činidla, amplifikační/detekční činidla, extrakční metoda, kvalita PCR přístroje a dalších nástrojů. K dubnu 2020 získalo povolení k nouzovému použití (EUA) pro diagnostiku COVID-196 více než 48 různých diagnostických zařízení z devíti zemí. V Etiopii se pro PCR detekci SARS-CoV-2 používá více než 14 platforem pro real-time PCR ve 26 veřejných zdravotnických zařízeních, včetně ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 a Quant-studio7. Kromě toho jsou k dispozici různé PCR testovací sady, jako je Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test a SARS-CoV-2 BGI test. Přestože je rRT-PCR vysoce citlivá, někteří pacienti s COVID-19 hlásí falešně negativní výsledky kvůli nedostatečnému počtu kopií virové ribonukleové kyseliny (RNA) ve vzorcích v důsledku nesprávného odběru, přepravy, skladování a manipulace a laboratorních testovacích podmínek a jednání personálu8. Kromě toho může nesprávná manipulace se vzorkem nebo kontrolou, nastavení prahu cyklu (Ct) a zkřížená reaktivita s jinými patogenními nukleovými kyselinami nebo inaktivní/zbytkovou RNA SARS-CoV-2 vést k falešně pozitivním výsledkům v testech rRT-PCR9. Je tedy zřejmé, že PCR testy skutečně dokáží identifikovat nositele genových fragmentů, protože nemohou rozlišit ani mezi skutečně aktivními virovými geny, takže testy dokáží identifikovat pouze nositele, nikoli pacienty10. Proto je důležité posoudit diagnostickou výkonnost v našem prostředí pomocí standardních metod. Ačkoli je v Etiopském institutu veřejného zdraví (EPHI) a v celé zemi k dispozici mnoho NAAT činidel, dosud nebylo publikováno žádné srovnávací hodnocení jejich účinnosti. Cílem této studie proto bylo vyhodnotit srovnávací výkonnost komerčně dostupných souprav pro detekci SARS-CoV-2 pomocí rRT-PCR s použitím klinických vzorků.
Do této studie bylo zahrnuto celkem 164 účastníků s podezřením na COVID-19. Většina vzorků pocházela z léčebných center (118/164 = 72 %), zatímco zbývajících 46 (28 %) účastníků pocházelo z center, která v centru nebyla léčena. Mezi účastníky, kteří nebyli v centru léčeni, mělo 15 (9,1 %) klinicky podezřelé případy a 31 (18,9 %) mělo kontakty s potvrzenými případy. Devadesát tři (56,7 %) účastníků byli muži a průměrný věk (± SD) účastníků byl 31,10 (± 11,82) let.
V této studii byly stanoveny míry pozitivních a negativních výsledků čtyř testů na COVID-19. Míry pozitivních výsledků testů Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI a Sansure Biotech 2019-nCoV byly tedy 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % a 55,5 %. Skóre pozitivního a negativního kompozitního referenčního standardu (CRS) bylo 97 (59,1 %) a 67 (40,9 %) (tabulka 1). V této studii byla definice CRS založena na pravidle „jakýkoli pozitivní“, kdy ze čtyř výsledků testů byly dva nebo více výsledků se stejným výsledkem považovány za skutečně pozitivní nebo negativní.
V této studii jsme zjistili negativní procentuální shodu (NPA) 100 % (95% interval spolehlivosti 94,6–100) u všech analýz ve srovnání s CRS. Analýza Sansure Biotechnology ukázala minimální PPA 93,8 % (95% interval spolehlivosti 87,2–97,1) a analýza Daan Gene 2019-nCoV měla celkovou shodu 99,4 % (95% interval spolehlivosti 96,6–99,9). Naproti tomu celková shoda mezi testem SARS-CoV-2 BGI a testem Sansure Biotech 2019-nCoV byla 98,8 %, respektive 96,3 % (tabulka 2).
Cohenův koeficient shody kappa mezi výsledky CRS a testu Abbott SARS-CoV-2 byl plně konzistentní (K = 1,00). Podobně jsou Cohenovy hodnoty kappa detekované testy Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI a Sansure Biotech 2019-nCoV také plně konzistentní s CRS (K ≥ 0,925). V této srovnávací analýze ukázal chí-kvadrát test (McNemarův test), že výsledky testu Sansure Biotech 2019-nCoV se významně lišily od výsledků CRS (p = 0,031) (tabulka 2).
Jak je znázorněno na Obr.1. Procento nejnižší hodnoty Ct (< 20 Ct) v testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RdRp a N) bylo 87,6 % a hodnota Ct genu ORF1a/b v testu Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že procento nízké hodnoty Ct (< 20 Ct) bylo 50,3 % a vysoké hodnoty Ct (36–40 Ct) 3,2 %. 1. Procento nejnižší hodnoty Ct (< 20 Ct) v testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RdRp a N) bylo 87,6 % a hodnota Ct genu ORF1a/b v testu Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že procento nízké hodnoty Ct (< 20 Ct) bylo 50,3 % a vysoké hodnoty Ct (36–40 Ct) 3,2 %.Jak je znázorněno na Obr.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинировансствилион) RdR 87,6 %, значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого низкачо низкачо низказало составлял 50,3 %, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2 %. 1, analýza nejnižší hodnoty Ct (< 20 Ct) viru Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RdRp a N) od firmy Sansure Biotech ukázala, že procento nejnižší hodnoty Ct (< 20 Ct) dle analýzy genu ORF1a/b viru Sansure Biotech 2019-nCoV představovalo 50,3 % a vysoké hodnoty Ct (36–40 Ct) 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比 tech，< 20 Ct 值百分比＼亸2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3 %，高Ct–40 Ct (36)的百分比为 3,2 %。 Jak je znázorněno na obrázku 1, nejnižší procentuální hodnota Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinace genu RdRp a N) je 87,6 %, hodnota Ct genu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV vykazuje nízké procentuální zastoupení Ct (< 20 Ct) 50,3 % a procentuální zastoupení Ct (36–40 Ct) 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp a N) имел саІное низкое значение Ct (< 20 Ct) v rozpětí 87,6 %, значение Ct гена ORF1a/b v исследовании Sansure Biotech 2019- АланиоззАнанио низкий Ct. Jak je znázorněno na obrázku 1, test Abbott SARS-CoV-2 (kombinující geny RdRp a N) měl nejnižší procentuální hodnotu Ct (< 20 Ct) na úrovni 87,6 %, zatímco hodnota Ct genu ORF1a/b ve studii Sansure Biotech 2019 – Analýza nCoV ukázala nízkou hodnotu Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3 %, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составис 3,2 %. Procento hodnot (< 20 Ct) bylo 50,3 % a procento vysokých hodnot Ct (36–40 Ct) bylo 3,2 %.Test Abbott SARS-CoV-2 B zaznamenal hodnoty Ct nad 30. Na druhou stranu, v testu BGI SARS-CoV-2 měl gen ORF1a/b vysokou hodnotu Ct (> 36 Ct), procento bylo 4 % (obr. 1). Na druhou stranu, v testu BGI SARS-CoV-2 měl gen ORF1a/b vysokou hodnotu Ct (> 36 Ct), procento bylo 4 % (obr. 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), трочотонение составлял 4 % (рис. 1). Na druhou stranu, v analýze BGI měl gen ORF1a/b viru SARS-CoV-2 vysokou hodnotu Ct (> 36 Ct), jejíž procentuální zastoupení činilo 4 % (obr. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比丼分比丼分比丼分比为分比丼分比为 4% Na druhou stranu, při detekci SARS-CoV-2 pomocí BGI je procento genu ORF1a/b s vysokou hodnotou Ct (>36 Ct) 4 % (obrázek 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b s высокими значенстиями Ct 4% (>36 Ct) (рис. 1). Na druhou stranu, v analýze BGI SARS-CoV-2 bylo procento genů ORF1a/b s vysokými hodnotami Ct ​​(>36 Ct) 4 % (obr. 1).
V této studii jsme odebrali 164 vzorků z nosohltanu. U všech typů testů byla izolace a amplifikace RNA provedena s použitím metod a souprav doporučených příslušnými výrobci.
Tato studie prokázala, že Abbottův test na SARS-CoV-2 má stejnou detekční účinnost jako CRS, se 100% pozitivní, negativní a celkovou shodou. Cohenova kappa shoda je 1,00, což ukazuje na plnou shodu s CRS. Podobná studie Washingtonské univerzity v USA zjistila, že celková citlivost a specificita Abbottova testu na SARS-CoV-2 byla 93 %, respektive 100 %, ve srovnání s laboratorně stanoveným testem (LDA) CDC. 11. Detekční systém Abbott SARS-CoV-2 je založen na současné kombinované detekci genů N a RdRp, protože oba geny jsou citlivější, což minimalizuje falešně negativní výsledky12. Studie ve Vídni v Rakousku také ukázala, že velké objemy extrakčních vzorků a objemy detekčního eluentu minimalizují účinky ředění a zvyšují účinnost detekce13. Abbottův perfektní test pro SARS-CoV-2 lze tedy spojit s detekčním systémem na platformě, který současně detekuje kombinatorické geny, extrahuje velké množství vzorků (0,5 ml) a používá velké množství eluentu (40 µl).
Naše výsledky také ukázaly, že detekční účinnost genetického testu Daan byla téměř stejná jako u CRS. To je v souladu se studií14 provedenou na Univerzitě Anhui v Huainanu v Číně a s tvrzením výrobce o 100% pozitivní shodě. Navzdory zprávám o konzistentních výsledcích byl jeden vzorek po opakovaném testování stejného eluátu falešně negativní, ale v testech Abbott SARS-CoV-2 a Sansure Biotech nCoV-2019 byl pozitivní. To naznačuje, že výsledky mohou být variabilní u různých typů testů. Nicméně ve studii provedené v Číně15 se výsledek testu Daan Gene významně lišil (p < 0,05) ve srovnání s jejich laboratorně definovaným referenčním testem. Nicméně ve studii provedené v Číně15 se výsledek testu Daan Gene významně lišil (p < 0,05) ve srovnání s jejich laboratorně definovaným referenčním testem. Тем не менее, v исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значиотелче 0,05) od toho лабораторного эталонного анализа. Nicméně ve studii v Číně15 se výsledek analýzy provedené společností Daan Gene významně lišil (p < 0,05) od analýzy jejich referenční laboratoře.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan зната отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Nicméně ve studii v Číně15 se výsledky Daanova genetického testu významně lišily (p < 0,05) ve srovnání s testem v referenční laboratoři.Tato nesrovnalost může být způsobena citlivostí referenčního testu k detekci SARS-CoV-2 a pro určení příčiny mohou být důležité další studie.
Naše studie dále hodnotila srovnávací výkonnost testu SARS-CoV-2 BGI s CRS a vykazovala vynikající pozitivní procentuální shodu (PPA = 97,9 %), negativní procentuální shodu (NPA = 100 %) a celkovou procentuální shodu podle pohlaví (OPA). = 98,8 %). Hodnoty Cohenovy Kappa ​​vykazovaly dobrou shodu (K = 0,975). Studie v Nizozemsku16 a Číně15 ukázaly konzistentní výsledky. Test SARS-CoV-2 BGI je test detekce jednoho genu (ORF1a/b) s použitím 10 µl amplifikačního/detekčního eluátu. Navzdory dobré statistické shodě s našimi referenčními výsledky analýza vynechala dva pozitivní vzorky (1,22 %) z celkového vzorku. To může mít obrovské klinické důsledky pro dynamiku přenosu jak na úrovni pacienta, tak na úrovni komunity.
Další srovnávací analýzou zahrnutou do této studie byl test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); celkové procento shody bylo 96,3 %. Síla shody byla také určena hodnotou Cohenova Kappa, která byla 0,925, což ukazuje na plnou shodu s CRS. Naše výsledky jsou opět shodné se studiemi provedenými na Central South University v Číně v Changsha a na klinickém laboratorním oddělení Liozhou People's Hospital v Liozhou City v Číně17. Přestože byla zaznamenána výše uvedená dobrá statistická shoda, chí-kvadrát test (MacNemarův test) ukázal, že výsledek testu Sansure Biotech vykazoval statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p < 0,005). Přestože byla zaznamenána výše uvedená dobrá statistická shoda, chí-kvadrát test (MacNemarův test) ukázal, že výsledek testu Sansure Biotech vykazoval statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическотретиответ хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеетачтатистиозенский различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Přestože byla zaznamenána výše uvedená dobrá statistická shoda, chí-kvadrát test (McNemarův test) ukázal, že výsledek testu Sansure Biotech se statisticky významně lišil ve srovnání s CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验，但卡方检验（MacNemar 检验）表明擣绚表明擣绚Sansure明擣绚相比具有统计学显着差异＂(p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ［ biotech 朣与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。〉） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат ( Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech a C Navzdory výše uvedené dobré statistické shodě vykazoval chí-kvadrát test (McNemarův test) statisticky významný rozdíl (p < 0,005) mezi testem Sansure Biotech a CRS.Šest vzorků (3,66 %) bylo ve srovnání s CRS falešně negativních (doplňková tabulka 1); to je velmi důležité, zejména vzhledem k dynamice přenosu viru. Výše ​​uvedené údaje také podporují tuto nízkou míru detekce15.
V této studii byly hodnoty Ct stanoveny pro každý test a příslušnou platformu, přičemž nejnižší průměrná hodnota Ct byla zaznamenána v testu Abbott SARS-CoV-2. Tento výsledek může souviset se systémem simultánního kombinovaného genetického testování společnosti Abbott pro detekci SARS-CoV-2. Podle obrázku 1 tedy 87,6 % výsledků Abbott SARS-CoV-2 mělo hodnoty Ct pod 20. Pouze malý počet výsledků vzorků (12,4 %) byl v rozmezí 20-30. Hodnoty Ct nad 30 nebyly zaznamenány. Kromě toho, že společnost Abbott používala formát genetického testování panelu SARS-CoV-2, může tento výsledek souviset s dolním detekčním limitem (32,5 kopií RNA/ml)18, který je třikrát nižší než dolní limit společnosti 100 kopií RNA/ml)19.
Tato studie má určitá omezení: zaprvé, kvůli nedostatku zdrojů nemáme standardní/referenční metody [jako je virová nálož nebo jiné laboratorní testy (LDA)]. Zadruhé, všechny vzorky použité v této studii byly výtěry z nosohltanu, zatímco výsledky nebyly použitelné pro jiné typy vzorků, a zatřetí, náš vzorek byl malý.
Tato studie porovnávala výkonnost čtyř rRT-PCR testů pro SARS-CoV-2 s použitím vzorků z nosohltanu. Všechny detekční testy měly téměř srovnatelnou výkonnost, s výjimkou testu Sansure Biotech. Kromě toho byla v testu Sansure Biotech zjištěna nízká míra pozitivity ve srovnání s CRS (p < 0,05). Kromě toho byla v testu Sansure Biotech zjištěna nízká míra pozitivity ve srovnání s CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результосRSиве презультостов 0,05). Test Sansure Biotech navíc vykazoval nízké procento pozitivních výsledků ve srovnání s CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов поно 0,05). Kromě toho měl test Sansure Biotech nižší míru pozitivity ve srovnání s CRS (p < 0,05).Analýza PPA, NPA a celkové shody dle Cohenova Kappa indexu (RUO) provedená společností Sansure Biotech překročila 93,5 % s hodnotou síly shody 0,925. Test Sansure Biotech (RUO) potřebuje pro použití v Etiopii další validaci a měl by být zvážen další výzkum k vyhodnocení tvrzení jednotlivých výrobců.
Srovnávací studie byla provedena ve čtyřech zdravotnických zařízeních v Addis Abebě: v nemocnici Eka Kotebe, v léčebném centru Millennium Church, v nemocnici Zewooditu Memorial Hospital a v specializované nemocnici pro tuberkulózu sv. Petra. Data byla shromážděna mezi 1. a 31. prosincem 2020. Zdravotnická zařízení pro tuto studii byla záměrně vybrána na základě vysokého počtu případů a dostupnosti velkých léčebných center ve městě. Podobně byly přístroje, včetně přístrojů pro real-time PCR ABI 7500 a Abbott m2000, vybrány podle doporučení výrobců činidel NAAT a pro tuto studii byly vybrány čtyři detekční sady PCR, protože většina laboratoří v Etiopii používala alespoň čtyři z nich. Během studie byl proveden genový test, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech a test SARS-CoV-2 BGI.
Testování na SARS-CoV-2 bylo provedeno od 1. do 30. prosince 2020 s použitím 3 ml virové transportní půdy (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Čína) u osob vyšetřovaných na COVID-19, které byly zaslány do EPHI. Vzorky z nosohltanu byly odebrány vyškolenými sběrateli vzorků a odeslány do EPHI v trojitých baleních. Před izolací nukleových kyselin je každému vzorku přiřazeno jedinečné identifikační číslo. Extrakce se provádí z každého vzorku ihned po jeho příchodu pomocí manuálních a automatických extrakčních metod. Pro automatickou extrakci Abbott m2000 bylo tedy z každého vzorku extrahováno 1,3 ml (včetně 0,8 ml mrtvého objemu a 0,5 ml vstupního objemu extrakce) vzorku a vzorky byly propuštěny systémem Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). Do celkového procesu (získávání a detekce) dvou kol testu SARS-CoV-2 (EUA) v reálném čase byla zahrnuta šarže 96 vzorků [92 vzorků, dvě detekční kontroly a dvě netemplátové kontroly (NTC)]. Podobně se pro manuální extrakci použijí stejné vzorky (pro automatickou extrakci a detekci). V průběhu celého procesu bylo tedy rozděleno 140 µl vzorků do alikvotních kvot a extrahováno pomocí sady QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Německo) v dávkách po 24 vzorkech (včetně 20 vzorků, dvou kontrolních vzorků a dvou NTC) v devíti cyklech. Ručně extrahované eluáty byly amplifikovány a detekovány pomocí termocykleru ABI 7500 s použitím testu SARS-CoV-2 BGI, testu Daan Gene a testu Sansure Biotech.
Automatická izolace a purifikace virové RNA SARS-CoV-2 se provádí na principu magnetických kuliček s použitím činidel pro přípravu vzorků DNA Abbott. Inaktivace vzorků a solubilizace virových částic se provádí pomocí detergentu obsahujícího guanidin isothiokyanát k denaturaci proteinu a inaktivaci RNázy. RNA se poté od proteinu oddělí separací na pevné fázi za použití oxidu křemičitého, tj. guanidiniová sůl a alkalické pH lyzačního pufru podporují vazbu nukleových kyselin na oxid křemičitý (SiO2). Krok oplachování odstraňuje zbývající proteiny a nečistoty za vzniku čirého roztoku. Transparentní RNA se izoluje z mikročástic na bázi oxidu křemičitého pomocí magnetického pole přístroje20,21. Na druhou stranu, manuální izolace a purifikace RNA se provádí metodou spin-column s použitím centrifugace namísto magnetického stojanu a separace mikročástic od eluentu.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) byl proveden dle pokynů výrobce, který obdržel EUA19,22 od WHO a FDA. V tomto protokolu byla inaktivace vzorku před extrakcí provedena ve vodní lázni při 56 °C po dobu 30 minut. Po inaktivaci viru byla provedena extrakce nukleových kyselin na přístroji Abbott m2000 SP z 0,5 ml VTM za použití systému pro přípravu vzorků DNA Abbott m2000 dle pokynů výrobce. Amplifikace a detekce byly provedeny pomocí přístroje Abbott m2000 RT-PCR a pro geny RdRp a N byla provedena duální detekce. Pro cílení a detekci interních kontrol byly použity barviva ROX) a VIC P (proprietární barvivo) pro cílení a detekci, což umožnilo simultánní detekci obou amplifikačních produktů 19.
Metoda detekce amplifikace této soupravy je založena na jednokrokové technologii RT-PCR. Geny ORF1a/b a N byly vybrány jako konzervované oblasti společností Daan Gene Technology pro detekci amplifikace cílové oblasti. Pro detekci RNA SARS-CoV-2 ve vzorcích byly navrženy specifické primery a fluorescenční sondy (sondy genu N značené FAM, sondy ORF1a/b značené VIC). Finální eluent a master mixy byly připraveny přidáním 5 µl eluentu k 20 µl master mixu na konečný objem 25 µl. Amplifikace a detekce byly provedeny současně na přístroji ABI 750024 pro real-time PCR.
Geny ORF1a/b a N byly detekovány pomocí diagnostické soupravy Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (detekce fluorescenční PCR). Pro každý cílový gen připravte specifické sondy výběrem kanálu FAM pro oblast ORF1a/b a kanálu ROX pro gen N. Do této testovací soupravy se přidá eluent a master mix reagencií takto: připravte 30 µl master mix reagencií a 20 µl eluovaného vzorku pro detekci/amplifikaci. Pro amplifikaci/detekci byla použita real-time PCR ABI 750025.
Test SARS-CoV-2 BGI je fluorescenční real-time rRT-PCR sada pro diagnostiku COVID-19. Cílová oblast se nachází v oblasti ORF1a/b genomu SARS-CoV-2, což je metoda detekce jednoho genu. Kromě toho je lidský housekeeping gen β-aktin vnitřně regulovaným cílovým genem. Master mix se připraví smícháním 20 µl činidla master mix a 10 µl extrahovaného vzorku RNA v jamkové destičce26. Pro amplifikaci a detekci byl použit fluorescenční kvantitativní real-time PCR přístroj ABI 7500. Veškerá amplifikace nukleových kyselin, podmínky PCR pro každý test a interpretace výsledků byly provedeny podle příslušných pokynů výrobce (tabulka 3).
V této srovnávací analýze jsme nepoužili metodu referenčního standardu k určení procentuální shody (pozitivní, negativní a celková) a dalších srovnávacích parametrů pro čtyři analýzy. Každé srovnání testů bylo provedeno pomocí CRS, v této studii byl CRS stanoven pravidlem „jakýkoli pozitivní“ a výsledek nebyl určen jedním testem, použili jsme alespoň dva porovnatelné výsledky testů. Kromě toho jsou v případě přenosu COVID-19 falešně negativní výsledky nebezpečnější než falešně pozitivní. Aby bylo možné co nejpřesněji z výsledku CRS říci „pozitivní“, musí být alespoň dva testy pozitivní, což znamená, že alespoň jeden pozitivní výsledek pravděpodobně pochází z testu EUA. Ze čtyř výsledků testů jsou tedy dva nebo více výsledků testů, které dávají stejný výsledek, považovány za skutečně pozitivní nebo negativní18,27.
Data byla shromážděna pomocí formulářů pro strukturovanou extrakci dat, zadávání a analýza dat byly provedeny pomocí statistického softwaru Excel a SPSS verze 23.0 pro deskriptivní statistiku. Byla analyzována pozitivní, negativní a celková procentuální shoda a pro určení stupně shody každé metody s CRS bylo použito skóre Kappa. Hodnoty Kappa jsou interpretovány následovně: 0,01 až 0,20 pro mírnou shodu, 0,21 až 0,40 pro všeobecnou shodu, 0,41–0,60 pro střední shodu, 0,61–0,80 pro významnou shodu a 0,81–0,99 pro úplnou shodu28.
Etické schválení bylo získáno od Univerzity v Addis Abebě a všechny experimentální protokoly pro tuto studii byly schváleny vědeckou etickou komisí Etiopského institutu veřejného zdraví. Referenční číslo etické licence EPHI je EPHI/IRB-279-2020. Všechny metody byly použity v souladu s doporučeními a ustanoveními Etiopských národních komplexních pokynů pro léčbu COVID-19. Před účastí ve studii byl navíc od všech účastníků studie získán písemný informovaný souhlas.
Veškerá data získaná nebo analyzovaná v této studii jsou zahrnuta v tomto publikovaném článku. Data podporující výsledky této studie jsou k dispozici u příslušného autora na základě přiměřené žádosti.
Světová zdravotnická organizace. Doporučení pro strategie laboratorního testování COVID-19: Prozatímní pokyny, 21. března 2020 č. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gourgoulianis, KI. Chytrá diagnostika COVID-19 na pohotovosti: Vše v praxi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gourgoulianis, KI. Chytrá diagnostika COVID-19 na pohotovosti: Vše v praxi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gurgulianis, KI. Inteligentní diagnostika COVID-19 na pohotovosti: vše v praxi.Muliou DS, Pantazopoulos I. a Gurgulyanis KI Inteligentní diagnostika COVID-19 na pohotovostech: komplexní integrace v praxi. Expert Reverend Respire. medicine. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL a St George, K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL a St George, K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL a St. George, K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL a St. George K. Hodnocení testu COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratorní detekce koronavirového onemocnění 2019 (COVID-19) u lidí s podezřením na onemocnění. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (přístup 15. srpna 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. a kol. Diagnóza COVID-19: Nemoci a testovací nástroje. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. a kol. Založení Kolegia patologů východní, střední a jižní Afriky – Regionální školy patologie Středního východu a Jižní Afriky. Afrika. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopský institut veřejného zdraví, Federální ministerstvo zdravotnictví. Prozatímní národní strategie a pokyny pro laboratorní diagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (přístup 12. srpna 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falešně negativní testy na infekci SARS-CoV-2 a jejich důsledky. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falešně negativní testy na infekci SARS-CoV-2 a jejich důsledky.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falešně negativní testy na infekce SARS-CoV-2 a jejich důsledky.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falešně negativní testy na provokaci a dopad infekce SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS a Gourgoulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: Strategie prevence a léčby respiračních onemocnění, očkování a další perspektivy. Mouliou, DS a Gourgoulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: Strategie prevence a léčby respiračních onemocnění, očkování a další perspektivy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные a ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторнафикика стратегии лечения, вакцинация a дальнейшие перспективы. Mouliou, DS a Gourgoulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: strategie prevence a léčby respiračních onemocnění, očkování a další postup.Muliu, DS a Gurgulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy COVID-19: strategie pro prevenci a léčbu respiračních onemocnění, očkování a další postup. Expert Reverend Respire. medicína. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidět strom, ale ztrácet les. Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidět strom, ale ztrácet les.Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidět strom, ztratit les.Muliou DS, Ioannis P. a Konstantinos G. Diagnóza COVID-19 na pohotovostech: Nedostatek lesa pro stromy. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. a kol. Validace a validace analytické a klinické výkonnosti testu Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce pomocí konvenční RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce pomocí konvenční RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatunyan, B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce pomocí konvenční RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Srovnání 5 různých genetických oblastí COVID-19 pro detekci virové infekce pomocí konvenční RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. a Aflatunyan B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu COVID-19 pro detekci virové infekce pomocí konvenční RT-PCR.Írán. Časopis mikrobiologie. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. a kol. Předběžné výsledky národního programu externího hodnocení kvality pro detekci genomových sekvencí SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. a kol. Analytické hodnocení účinnosti pěti RT-PCR souprav pro koronavirus 2 s těžkým akutním respiračním syndromem. J. Clinical. laboratory. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. a kol. Hodnocení sedmi komerčně dostupných souprav pro detekci RNA SARS-CoV-2 v Číně založených na polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. clinical. Chemical. laboratory. medicine. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB a kol. Srovnání sedmi komerčních diagnostických sad RT-PCR pro COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu a kol. Porovnání diagnostické účinnosti dvou PCR kitů pro detekci nukleových kyselin SARS-CoV-2. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR atd. Srovnávací studie čtyř platforem pro testování amplifikace nukleových kyselin (NAAT) u SARS-CoV-2 ukázala, že výkon ID NOW byl významně snížen v závislosti na pacientovi a typu vzorku. diagnóza. mikrobiologie. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbottova molekula. Příbalový leták k analýze SARS-CoV-2 v reálném čase od firmy Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (K 10. srpnu 2020) (2020).
Klein, S. a kol. Izolace RNA SARS-CoV-2 s použitím magnetických kuliček pro rychlou detekci ve velkém měřítku pomocí RT-qPCR a RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).