Výkon čtyř testů amplifikace nukleových kyselin pro identifikaci SARS-CoV-2 v Etiopii

Děkujeme za návštěvu Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Pro nejlepší zážitek doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo zakázat režim kompatibility v Internet Explorer). Kromě toho, abychom zajistili pokračující podporu, zobrazíme web bez stylů a javascript.
Zobrazuje kolotoč tří snímků najednou. Pomocí předchozích a dalších tlačítek se pohybujte třemi sklíčkami najednou, nebo pomocí tlačítek posuvníku na konci přesuňte tři snímky najednou.
Od vypuknutí koronavirové choroby v roce 2019 (COVID-19) bylo po celém světě vyvinuto mnoho komerčních testů amplifikace nukleových kyselin (NAATS) a staly se standardními testy. Ačkoli několik testů bylo rychle vyvinuto a aplikováno na laboratorní diagnostické testy, výkon těchto testů nebyl vyhodnocen v různých prostředích. Tato studie se proto zaměřila na vyhodnocení výkonu Abbott SARS-CoV-2, DAAN Gene, BGI a Sansure Biotech testů pomocí kompozitního referenčního standardu (CRS). Studie byla provedena v Etiopském institutu pro veřejné zdraví (EPHI) od 1. do 30. prosince 2020 164 vzorků nosofaryngeálních vzorků bylo extrahováno pomocí systému QIAAMP RNA Mini a Abbott DNA vzorek přípravy. Ze 164 vzorků bylo 59,1% kladných a 40,9% bylo negativních na CRS. Pozitivita biotechnologií Sansure byla významně nízká ve srovnání s CRS (p <0,05). Pozitivita biotechnologií Sansure byla významně nízká ve srovnání s CRS (p <0,05). Положительные результа obale Pozitivní výsledky Sansure Biotech byly ve srovnání s CRS výrazně nižší (p <0,05).与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低（ P <0,05）。与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低（ P <0,05）。 У Sansure Biotech ыыло значительно менше положительных результа obale Sansure Biotech měl výrazně méně pozitivních výsledků ve srovnání s CRS (p <0,05).Celková shoda čtyř analýz byla ve srovnání s CRS 96,3–100%. Kromě nízké míry pozitivity biotechnologického testu Sansure byl výkon čtyř testů téměř srovnatelný. Test Sansure Biotech [pouze pro výzkum (RUO)] jako takový vyžaduje další ověření pro jeho použití v Etiopii. Nakonec by měl být zvážen další výzkum, který vyhodnotí testy s příslušnými nároky výrobce.
Laboratorní testování je součástí Světové zdravotnické organizace (WHO) Strategického plánu pro koronavirovou chorobu 2019 (COVID-19) připravenost a reakci (SPRP). Kdo radí, že země musí vybudovat laboratorní kapacitu ke zlepšení připravenosti, správné správy případů, bdělosti a rychlé reakce na výzvy v oblasti veřejného zdraví. To naznačuje, že role laboratoře je klíčem k charakterizaci onemocnění a epidemiologie rozvíjejících se infekčních látek a kontrole jejich šíření.
Diagnóza CoVID-19 vyžaduje epidemiologické a lékařské informace, osobní příznaky/příznaky a radiografické a laboratorní údaje2. Od doby, kdy bylo v Číně hlášeno ohnisko CoVID-19, bylo po celém světě vyvinuto mnoho komerčních amplifikačních testů nukleových kyselin (NAATS). Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RRT-PCR) byla použita jako rutinní a standardní metoda pro laboratorní diagnózu infekce závažného akutního respiračního syndromu 2 (SARS-CoV-2) 3. Molekulární detekce SARS-CoV-2 je obvykle založena na genu N (nukleocapsid protein), E (E (Envelope Protein Gene) a RDRP (RNA-dependentní genu RNA polymerázy) v ORF1A/B (otevřený čtecí rámec 1A/B). Gene) oblast identifikovaná z virového genomu. Jsou považovány za hlavní konzervované oblasti nalezené ve virových genomech pro rozpoznávání virů4. Mezi těmito geny mají geny RDRP a E vysokou analytickou citlivost detekce, zatímco g gen má nízkou analytickou citlivost5.
Výkon testů PCR se může lišit v závislosti na různých faktorech, jako jsou: extrakční činidla, amplifikační/detekční činidla, metoda extrakce, kvalita stroje PCR a další nástroje. Od dubna 2020 bylo více než 48 různých diagnostických zařízení z devíti zemí pro diagnostiku COVID-196 oprávnění (EUA) povolení k nouzovému použití (EUA). V Etiopii se pro detekci PCR SARS-CoV-2 používá více než 14 platforem PCR v reálném čase na 26 institucích veřejného zdraví, včetně ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 a Quant-Studio7. Kromě toho jsou k dispozici různé testovací soupravy PCR, jako je genový test DAAN, test Abbott SARS-CoV-2, test biotechnologického testu a test SARS-CoV-2 BGI. Přestože je RRT-PCR vysoce citlivá, někteří pacienti s COVID-19 uvádějí falešné negativní výsledky kvůli nedostatečným kopiím virové ribonukleové kyseliny (RNA) ve vzorcích v důsledku nesprávného sběru, transportu, skladování a manipulace a laboratorního testování. Podmínky a akce personálu8. Kromě toho může vzorek nebo kontrolní zacházení, nastavení prahu cyklu (CT) a zkřížená reaktivita s jinými patogenními nukleovými kyselinami nebo neaktivními/zbytkovými RNA SARS-CoV-2 RNA může vést k falešným pozitivním výsledkům v testech RRT-PCR9. Je tedy zřejmé, že testy PCR mohou skutečně identifikovat nosiče fragmentů genů, protože nemohou ani rozlišovat mezi skutečně aktivními virovými geny, takže testy mohou identifikovat pouze nosiče a nikoli pacienty10. Proto je důležité posoudit diagnostický výkon pomocí standardních metod v našem nastavení. Ačkoli mnoho činidel NAAT je k dispozici v Etiopském institutu pro veřejné zdraví (EPHI) a v celé zemi, dosud nebylo hlášeno žádné srovnávací hodnocení jejich účinnosti. Cílem této studie se proto zaměřilo na zhodnocení srovnávací výkonnosti komerčně dostupných souprav pro detekci SARS-CoV-2 pomocí RRT-PCR pomocí klinických vzorků.
Do této studie bylo zahrnuto celkem 164 účastníků s podezřením na Covid-19. Většina vzorků pocházela z léčebných středisek (118/164 = 72%), zatímco zbývajících 46 (28%) účastníků pocházelo z neléčení. Mezi účastníky, kteří nebyli léčeni ve středu, mělo 15 (9,1%) klinicky podezřelé případy a 31 (18,9%) mělo kontakty potvrzených případů. Devadesát tři (56,7%) účastníci byli muži a průměrný (± SD) věk účastníků byl 31,10 (± 11,82) let.
V této studii byla stanovena pozitivní a negativní míra čtyř testů pro COVID-19. Pozitivní míry testu Abbott SARS-CoV-2, test DAAN Gen 2019-NCOV, test SARS-CoV-2 BGI a Sansure Biotech 2019-NCOV test byly 59,1%, 58,5%, 57,9% a 55,5%. Skóre pozitivních a negativních kompozitních referenčních standardů (CRS) bylo 97 (59,1%) a 67 (40,9%), v tomto pořadí (tabulka 1). V této studii byla definice CRS založena na „jakémkoli pozitivním“ pravidle, přičemž ze čtyř výsledků testů byly dva nebo více výsledků testů, které poskytly stejný výsledek, považovány za skutečné pozitivní nebo negativní.
V této studii jsme zjistili negativní procentuální dohodu (NPA) 100% (95% CI 94,6–100) pro všechny analýzy ve srovnání s CRS. Analýza biotechnologií sansure ukázala minimální PPA 93,8% (95% CI 87,2-97.1) a analýza DAAN Gen 2019-NCOV měla celkovou shodu 99,4% (95% CI 96,6-99,9). Naproti tomu celková shoda mezi testem SARS-CoV-2 BGI a testem Sansure Biotech 2019-NCOV byla 98,8%, respektive 96,3% (tabulka 2).
Cohenův koeficient dohody Kappa mezi výsledky testu CRS a Abbott SARS-CoV-2 byl plně konzistentní (k = 1,00). Podobně jsou hodnoty Kappa Cohen detekované DAAN Genem 2019-NCOV, SARS-CoV-2 BGI a Sansure Biotech 2019-NCOV také plně v souladu s CRS (K ≥ 0,925). V této srovnávací analýze test chi-kvadrát (McNemar test) ukázal, že výsledky testu sansure Biotech 2019-NCOV se významně lišily od výsledků CRS (p = 0,031) (tabulka 2).
Jak je znázorněno na obr.1 Procento nejnižší hodnoty CT (<20 CT) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RDRP a N) bylo 87,6% a genová hodnota genu ORF1A/B a vysoká hodnota CT (36–40 ct) byla 50,3% (36–40 ct) byla 36–40 ct) (36–40 ct) (36–40 ct) byla 36–40 ct) (36–40 ct) (360 ct) byla 50,3%. 1 Procento nejnižší hodnoty CT (<20 CT) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gen RDRP a N) bylo 87,6% a genová hodnota genu ORF1A/B a vysoká hodnota CT (36–40 ct) byla 50,3% (36–40 ct) byla 36–40 ct) (36–40 ct) (36–40 ct) byla 36–40 ct) (36–40 ct) (360 ct) byla 50,3%.Jak je znázorněno na obr.1, процент наииеншшего значения CT (<20 ct) анализа Abbott Sars-Cov-2 (комбинированный генен nebude а з im) ORF1A/B анализа Sansure BioTech 2019-ncov показало чо процент низкого значения Ct (<20 ct) составля 50,3%, а а а а а ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы. составляло 3,2%. 1, the percentage of the lowest Ct value (< 20 Ct) analysis of Abbott SARS-CoV-2 (combined gene RdRp and N) was 87.6%, and the Ct value of ORF1a/b gene analysis of Sansure Biotech 2019-nCoV showed that the percentage of low Ct value (< 20 Ct) accounted for 50.3%, and high value Ct (36–40 Ct) accounted for 3.2%.如图 1 所示 ， Abbott SARS-CoV-2 检测（结合 RDRP 和 N 基因） 的最低 CT 值百分比（ <20 CT） 为 87,6%， Sansure Biotech 2019-ncov 检测的 ORF1A/B 基因 Ct 值显示低 Ct 值 (<20 ct) 的百分比为 50,3%， ， Ct) Jak je znázorněno na obrázku 1, nejnižší procento hodnoty CT (<20 ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinace genu RDRP a n) je 87,6%, hodnota genu ORF1A/B je hodnota genu ORF1A/B 50,3%, 高 Ct 值 Ct 值 高 Ct 值 值 Ct 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 CT). Как показано на рисунке 1, анализ Abbott Sars-Cov-2 (сочетающий гены drp n) размере 87,6%, а значение Ct ген or orf1a/b исследовани sansure BioTech 2019- анализ ncov показал низ restauraci. Jak je znázorněno na obrázku 1, test Abbott SARS-CoV-2 (kombinující geny RDRP a N) měl nejnižší procento CT hodnoty (<20 ct) při 87,6%, zatímco hodnota CT genu ORF1A/B ve studii Sansure BioTech 2019-ukázala nízkou CT. Процент значений (<20 ct) составил 50,3%, а процент Procento hodnot (<20 ct) bylo 50,3%a procento vysokých hodnot CT (36–40 ct) bylo 3,2%.Test Abbott SARS-CoV-2 B zaznamenal hodnoty CT nad 30. Na druhé straně, na testu BGI SARS-CoV-2 ORF1A/B měl procento vysoké hodnoty (> 36 ct) 4% (obr. 1). Na druhé straně, na testu BGI SARS-CoV-2 ORF1A/B měl procento vysoké hodnoty (> 36 ct) 4% (obr. 1). С другой стороны, анализе bgi sars-cov-2 ген orf1a/b имел ыыокое значенн сос с с с р р риlat. 1). Na druhé straně, v analýze genu BGI SARS-CoV-2 ORF1A/B mělo vysokou hodnotu CT (> 36 CT), jejíž procento bylo 4% (obr. 1).另一方面 ， 在 BGI SARS-CoV-2 检测中 ， ORF1A/B 基因具有高 CT 值（> 36 CT） 的百分比为 4%（图 1）。 Na druhé straně, při detekci BGI SARS-CoV-2 je procento genu ORF1A/B s vysokou hodnotou CT (> 36 CT) 4% (obrázek 1). С другой стороны, анализе bgi sars-cov-2 процент генов ORF1A/b с с с р р ы р рvra. 1). Na druhé straně, v analýze BGI SARS-CoV-2 bylo procento genů ORF1A/B s vysokými hodnotami CT (> 36 CT) 4% (obr. 1).
V této studii jsme vzali 164 vzorků nosofaryngeálních. Pro všechny typy testů byla provedena izolace a amplifikace RNA pomocí metod a souprav doporučených příslušnými výrobci.
Tato studie prokázala, že Abbottův test na SARS-CoV-2 má stejný detekční výkon jako CRS, se 100% pozitivní, negativní a celkovou shodou. Cohenova dohoda Kappa je 1,00, což naznačuje plnou dohodu s CRS. Podobná studie University of Washington v USA zjistila, že celková citlivost a specificita Abbottova testu pro SARS-CoV-2 byla 93%, respektive 100%, ve srovnání s laboratorním testem (LDA) CDC. 11. Detekční systém Abbott SARS-CoV-2 je založen na simultánní kombinované detekci genů N a RDRP, protože oba geny jsou citlivější a minimalizují falešné negativy12. Studie ve Vídni ve Rakousku také ukázala, že velké objemy extrakce vzorku a detekční objemy eluentu minimalizovaly zředěné účinky a zvýšená účinnost detekce13. Abbottova dokonalá shoda pro test SARS-CoV-2 tedy může být spojena se systémem detekce platformy, který současně detekuje kombinatorické geny, extrahuje velké množství vzorků (0,5 ml) a používá velké množství eluentu (40 ul).
Naše výsledky také ukázaly, že detekční výkon genetického testu DAAN byl téměř stejný jako výkon CRS. To je v souladu se studiem14 provedenou na Anhui University v Huainan v Číně a nárokem výrobce na 100% pozitivní dohodu. Navzdory zprávám o konzistentních výsledcích byl jeden vzorek po opakovaném testování stejného eluátu falešně negativní, ale byl pozitivní v testech Abbott SARS-CoV-2 a Biotech NCOV-2019 sannure. To naznačuje, že může existovat variabilita výsledků v různých typech testů. Nicméně ve studii provedené v Číně15 byl výsledek testu genu DAAN významně odlišný (p <0,05) ve srovnání s jejich laboratorním referenčním testem. Nicméně ve studii provedené v Číně15 byl výsledek testu genu DAAN významně odlišný (p <0,05) ve srovnání s jejich laboratorním referenčním testem. Тем не менее, в исследовании, проведенном к к к р результат анализа daan gene лабораторного эталоного анализа. Avšak ve studii v Číně15 byl výsledek analýzy DAAN Gene výrazně odlišný (p <0,05) od jejich laboratorní referenční analýzy.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（ P <0,05）。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако в ис užspo, проведенном китае15, результаты генетического теста daan значительн отлис с (p <0,05) сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Ve studii v Číně15 však byly výsledky genetického testu Daana významně odlišné (P <0,05) ve srovnání s referenčním laboratorním testem.Tato nesrovnalost může být způsobena citlivostí referenčního testu na detekci SARS-CoV-2 a pro stanovení příčiny mohou být důležité další studie.
Kromě toho naše studie vyhodnotila srovnávací výkon testu SARS-CoV-2 BGI s CRS, což vykazuje vynikající pozitivní procentuální dohodu (PPA = 97,9%), negativní procentuální dohodu (NPA = 100%) a celkovou procentuální dohodu podle pohlaví (OPA). ). = 98,8%). Cohenovy hodnoty Kappa ukázaly dobrou shodu (k = 0,975). Studie v Nizozemsku16 a Číně15 prokázaly konzistentní výsledky. Test SARS-CoV-2 BGI je detekční test jediného genu (ORF1A/B) pomocí 10 ul amplifikace/detekce eluátu. Navzdory dobré statistické shodě s našimi referenčními výsledky zmeškala analýza dva pozitivní vzorky (1,22%) z celkového vzorku. To může mít obrovské klinické důsledky pro dynamiku přenosu na úrovni pacienta i komunity.
Další srovnávací analýza zahrnutou v této studii byl test RRT-PCR (RRT-PCR) sansure; Celkové procento shody bylo 96,3%. Síla dohody byla také určena hodnotou Kappa Cohen, která byla 0,925, což naznačuje plnou shodu s CRS. Naše výsledky jsou opět totožné se studiemi prováděnými na Central South University v Changsha v Číně a na klinické laboratorní oddělení lidové nemocnice Liuzhou, Liuzhou City, China17. Přestože byla zaznamenána výše uvedená dobrá statistická shoda, test Chi-square (MacNemar Test) ukázal, že výsledek biotechnologického testu Sansure měl statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p <0,005). Přestože byla zaznamenána výše uvedená dobrá statistická shoda, test Chi-square (MacNemar Test) ukázal, že výsledek biotechnologického testu Sansure měl statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p <0,005). Несмотря на то, что было зафик oba¡аное ышыше хорошее с квйй х х-йй х х-йй хх рийй х р-ий х к кийй х к кийй х рииййх х р кийй х к кий х к к к р р р к р к р х к к к к к к к к к к р к к к к к к к к к к к р к к р р р к к р к к к к к р р к к к к к к к к к к к к к к к к к к к к к к (критерий макнемара) показал, что результат анализа sansure biotech и срачее moucně 0,005). Ačkoli byla zaznamenána dobrá statistická shoda výše, test chi-kvadrát (McNemar Test) ukázal, že výsledek biotechnologického testu sannace měl statisticky významný rozdíl ve srovnání s CRS (p <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验（ MacNemar 检验） 表明 ， Sansure Biotech 检测的结果与 Crs 相比具有统计学显着差异（ P <0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 （（ （（ MacNemar 检验 表明 ， ， Sanure Biotech 检测 与 Crs 相比 具有 显着 （（ （（ （（ （（ （（ （（ （（ （（ P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））） Несмотря на отмеченное ышыше хорошее статистическое соответнезарар кроте л) статистически значимую разницу (P <0,005) между анализом Sanure Biotech и Crs. Navzdory výše uvedené dobré statistické dohodě ukázal test chi-kvadrát (McNemar test) statisticky významný rozdíl (P <0,005) mezi biotechnologickou testem sansure a CRS.Bylo zjištěno, že šest vzorků (3,66%) jsou falešné negativy ve srovnání s CRS (doplňková tabulka 1); To je velmi důležité, zejména vzhledem k dynamice přenosu viru. Výše uvedená data také podporují tuto nízkou rychlost detekce15.
V této studii byly hodnoty CT stanoveny pro každý test a příslušnou platformu, s nejnižší průměrnou hodnotou CT uvedenou v testu Abbott SARS-CoV-2. Tento výsledek může souviset s Abbottovým simultánním systémem kombinovaného genetického testování pro detekci SARS-CoV-2. Proto podle obrázku 1 mělo 87,6% výsledků Abbott SARS-CoV-2 hodnoty pod 20. V rozmezí 20-30 bylo pouze malý počet výsledků vzorku (12,4%). Hodnoty CT nad 30 nebyly zaznamenány. Kromě použití Abbottova použití formátu genetického testování panelu SARS-CoV-2 může tento výsledek souviset s nižším detekčním limitem (32,5 RNA kopií/ml) 18, což je třikrát nižší než spodní limit společnosti 100 RNA/ml. ML) 19.
Tato studie má určitá omezení: Nejprve nemáme standardní/referenční metody [jako je virová zátěž nebo jiné laboratorní testy (LDA)] kvůli nedostatku zdrojů. Za druhé, všechny vzorky použité v této studii byly nosofaryngeální výtěry, zatímco výsledky nebyly použitelné na jiné typy vzorků a třetí, naše velikost vzorku byla malá.
Tato studie porovnávala výkon čtyř testů RRT-PCR pro SARS-CoV-2 pomocí vzorků nosopharyngeálních. Všechny detekční testy měly téměř srovnatelný výkon, s výjimkou testu biotechnologií Sansure. Kromě toho byla nízká míra pozitivity identifikována v testu biotechnologií Sansure ve srovnání s CRS (p <0,05). Kromě toho byla nízká míra pozitivity identifikována v testu biotechnologií Sansure ve srovnání s CRS (p <0,05). Кроме того, т тесте sansure biotech ыыл ыывлен низкий процент положительных Kromě toho test biotechnologií Sansure vykazoval nízké procento pozitivních výsledků ve srovnání s CRS (p <0,05).此外 ， 与 Crs 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0,05)。此外 ， 与 Crs 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech и и с у Crs (P <0,05). Kromě toho měl biotechnologický test Sansure nižší míru pozitivity ve srovnání s CRS (p <0,05).Analýza PPA, NPA a celkové dohody přesahovala 93,5% s hodnotou dohody 0,925 analýza PPA, NPA a celkové dohody ozbrojené biotechnologické NCOV-2019 (RUO). A konečně, test Sansure Biotech Assay (RUO) potřebuje další validaci pro použití v Etiopii a je třeba zvážit další výzkum, který by vyhodnotil nároky jednotlivých výrobců.
Srovnávací návrh studie byl prováděn ve čtyřech zdravotnických zařízeních ve společnosti Addis Abeba, nemocnice Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Center Center, Memorial Hospital Zewooditu a Specializované nemocnici sv. Petra. Údaje byly shromážděny mezi 1. a 31. prosincem 2020. Zdravotnická zařízení pro tuto studii byla záměrně vybrána na základě jejich vysokého počtu případů a dostupnosti hlavních léčebných středisek ve městě. Podobně byly nástroje, včetně přístrojů PCR v reálném čase a ABBOTT M2000 a ABBOTT M2000, vybrány podle doporučení výrobců činidla NAAT a pro tuto studii byly vybrány čtyři soupravy pro detekce PCR, protože většina laboratoří v Etiopii byla použita nejméně nejméně čtyři z nich. Během studie provedl genový test, test Abbott SARS-CoV-2, test sansure biotechnologie a test SARS-CoV-2 BGI).
Testování na SARS-CoV-2 bylo provedeno od 1. do 30. prosince 2020 s použitím 3 ml virového transportního média (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Čína) od jednotlivců, kteří byli zkoumáni pro Covid-19, který byl odkazován na Ephi. Vzorky nosopharyngeálních vzorků byly odebrány vyškolenými sběrateli vzorků a poslány do Ephi v trojitých balíčcích. Před izolací nukleové kyseliny je každému vzorku přiřazeno jedinečné identifikační číslo. Extrakce se provádí z každého vzorku bezprostředně po příjezdu pomocí manuální a automatické metody extrakce. Pro automatickou extrakci Abbott M2000 bylo tedy z každého vzorku extrahováno 1,3 ml (včetně 0,8 ml mrtvého objemu a 0,5 ml extrakce) vzorku a prošla systémem přípravy vzorku Abbott Molecular Inc. des, IL, USA). ) Do celkového procesu (vyhledávání a detekce) dvou kol SARS-CoV-2 (EUA) v reálném čase byla zahrnuta šarže 96 [92 vzorků SARS-CoV-2 (EUA). hornictví. Podobně pro manuální extrakci použijte stejné vzorky (pro automatickou extrakci a objev). V průběhu celého procesu bylo tedy 140 ul vzorků alikvotováno a extrahováno pomocí sady QIAAMP virových RNA (Qiagen GmbH, Hilden, Německo) v dávkách 24 (včetně 20 vzorků, dvou kontrol testu a dvou NTC) během devíti kol. Ručně extrahované eluáty byly amplifikovány a detekovány pomocí tepelného cykliru ABI 7500 pomocí testu SARS-CoV-2 BGI, testu genu DAAN a biotechnologického testu.
Automatizovaná izolace a čištění virové RNA SARS-CoV-2 se řídí principem magnetických kuliček pomocí činidel přípravy vzorku Abbott DNA. Inaktivace vzorků a solubilizace virových částic se provádí pomocí detergentu obsahujícího guanidin isothiokyanát, aby denaturoval protein a inaktivoval RNázu. RNA je poté oddělena od proteinu separací pevné fáze pomocí oxidu křemičitého, tj. Guanidiniová sůl a alkalický pH lýzového pufru podporuje vazbu nukleových kyselin na oxid křemičitý (SIO2). Krok propláchnutí odstraňuje zbývající proteiny a zbytky za vzniku jasného řešení. Průhledná RNA je izolována z mikročástic na bázi oxidu křemičitého pomocí magnetického pole přístroje20,21. Na druhé straně je manuální izolace a čištění RNA prováděna metodou Spin sloupce pomocí centrifugace namísto magnetického stojanu a separaci mikročástic od eluentu.
Detekční test Abbott v reálném čase SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) byl proveden podle pokynů výrobce, který obdržel EUA19,22 od WHO a FDA. V tomto protokolu byla inaktivace vzorku před extrakcí provedena ve vodní lázni při 56 ° C po dobu 30 minut. Po inaktivaci viru byla provedena extrakce nukleových kyselin na nástroji Abbott M2000 SP od 0,5 ml VTM pomocí systému přípravy vzorku DNA Abbott M2000. Podle výrobce. Amplifikace a detekce byla provedena pomocí přístroje Abbott M2000 RT-PCR a pro geny RDRP a N byla provedena duální detekce. Rox) a VIC P (proprietární barvivo) pro cílení a detekci vnitřních kontrol, což umožňuje současnou detekci obou amplifikačních produktů 19.
Metoda detekce amplifikace této soupravy je založena na jednostupňové technologii RT-PCR. Geny ORF1A/B a N byly vybrány jako konzervované oblasti genovou technologií DAAN k detekci amplifikace cílové oblasti. Specifické primery a fluorescenční sondy (n genové sondy označené FAM, ORF1A/B sondy označenými VIC) byly navrženy pro detekci SARS-CoV-2 RNA ve vzorcích. Poslední eluentní a hlavní směsi byly připraveny přidáním 5 ul eluentu do 20 ul hlavní směsi do konečného objemu 25 ul. Amplifikace a detekce byly prováděny současně na přístroji PCR v reálném čase ABI 750024.
Geny ORF1A/B a N byly detekovány za použití diagnostické soupravy Nukleové kyseliny Biotech NCOV-2019 (fluorescenční PCR detekce). Připravte specifické sondy pro každý cílový gen výběrem kanálu FAM pro oblast ORF1A/B a ROX kanálu pro g gen. K této testovací soupravě jsou činidla Eluentu a Master Mix přidána následovně: Připravte 30 ul činidlo hlavní mix a 20 ul eluovaného vzorku pro detekci/amplifikaci. Pro amplifikaci/detekci byla použita PCR ABI 750025 v reálném čase.
Test SARS-CoV-2 BGI je souprava RRT-PCR v reálném čase pro diagnózu CoVID-19. Cílová oblast je umístěna v oblasti ORF1A/B genomu SARS-CoV-2, což je metoda detekce jediného genu. Kromě toho je lidský gen domácnosti β-aktin interně regulovaný cílový gen. Hlavní směs je připravena smícháním 20 ul činidla hlavní směsi a 10 ul extrahovaného vzorku RNA v Well Plate26. Pro amplifikaci a detekci byl použit fluorescenční kvantitativní přístroj PCR v reálném čase ABI 7500. Všechny amplifikace nukleové kyseliny, podmínky PCR pro každý test a interpretace výsledků byly provedeny podle pokynů příslušného výrobce (tabulka 3).
V této srovnávací analýze jsme nepoužili referenční standardní metodu k určení procentní shody (pozitivní, negativní a celkově) a další parametry srovnání pro čtyři analýzy. Každé porovnání testu bylo provedeno s CRS, v této studii byl CRS stanoven pravidlem „jakýkoli pozitivní“ a výsledek byl stanoven, nikoli jediným testem, použili jsme alespoň dva výsledky porovnávaných testů. Kromě toho jsou v případě přenosu COVID-19 falešně negativní výsledky nebezpečnější než falešně pozitivní výsledky. Proto, aby bylo možné říci „pozitivní“ co nejpřesněji z výsledku CRS, musí být alespoň dva testy testů pozitivní, což znamená, že alespoň jeden pozitivní výsledek pravděpodobně pochází z testu EUA. Ze čtyř výsledků testů jsou tedy dva nebo více výsledků testů, které poskytují stejný výsledek, považovány za skutečné pozitivní nebo negativní18,27.
Data byla shromažďována pomocí strukturovaných formulářů pro extrakci dat, zadávání a analýza dat byla provedena pomocí statistického softwaru Excel a verze SPSS 23.0 pro popisné statistiky. Byla analyzována pozitivní, negativní a celková procentní shoda a k určení stupně shody každé metody s CRS bylo použito skóre Kappa. Hodnoty Kappa jsou interpretovány takto: 0,01 až 0,20 pro mírnou dohodu, 0,21 až 0,40 pro obecnou dohodu, 0,41-0,60 pro mírnou dohodu, 0,61-0,80 pro velkou dohodu a 0,81-0,99 pro úplnou dohodu28.
Etická povolení byla získána z University of Addis Abeba a všechny experimentální protokoly pro tuto studii byly schváleny radou pro vědecké etické hodnocení etiopského veřejného zdraví. Referenční číslo pro etickou licenci EPHI je EPHI/IRB-279-2020. Všechny metody byly použity v souladu s doporučeními a ustanoveními etiopských národních komplexních pokynů pro léčbu COVID-19. Kromě toho byl před účastí ve studii získán písemný informovaný souhlas od všech účastníků studie.
Všechna data získaná nebo analyzovaná v této studii jsou zahrnuty v tomto publikovaném článku. Data podporující výsledky této studie jsou k dispozici od příslušného autora na přiměřenou žádost.
Světová zdravotnická organizace. Doporučení pro strategie laboratorního testování pro COVID-19: prozatímní pokyny, 21. března 2020 č. WHO/2019-NCOV/LAB_TESTING/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, Ki Covid-19 Inteligentní diagnóza na pohotovostním oddělení: All-in v praxi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, Ki Covid-19 Inteligentní diagnóza na pohotovostním oddělení: All-in v praxi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gurgulianis, Ki inteligentní diagnostika Covid-19 na pohotovostním oddělení: vše v praxi.Muliou DS, Pantazopoulos I. a Gurgulyanis ki inteligentní diagnostika Covid-19 v pohotovostních odděleních: integrace end-to-end v praxi. Expert Ctihodný respire. lék. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & ST George, K. Vyhodnocení ID COVID19 nyní test EUA. Mitchell, SL & ST George, K. Vyhodnocení ID COVID19 nyní test EUA.Mitchell, SL a St. George, K. Hodnocení ID COVID19 nyní test EUA.Mitchell SL a St. George K. Vyhodnocení ID COVID19 nyní test EUA. J. Klinická. Virus. 128, 104429. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
SZO. Laboratorní detekce koronavirové choroby 2019 (COVID-19) u podezřelých lidských chorob. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (přístupné 15. srpna 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. a kol. Diagnóza CoVID-19: nemoci a nástroje pro testování. ACS Nano 14 (4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Zřízení vysoké školy patologů východní, střední a jižní Afriky - regionální škola patologie Středního východu a Jižní Afriky. Afrika. J. Lab. lék. 9 (1), 1-8 (2020).
Etiopský institut veřejného zdraví, Federální ministerstvo zdravotnictví. Prozatímní národní strategie a pokyny pro laboratorní diagnózu CoVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/ephi_pheoc_covid-19_laboratory_diagnosis_eng.pdf (přístup k 12. srpnu 2020) (Ephi, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, jako falešně negativní testy na výzvy a důsledky infekce SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, jako falešně negativní testy na výzvy a důsledky infekce SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim jako falešně negativní testy na infekce SARS-CoV-2 a jejich důsledky.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim jako falešně negativní testy na provokaci a dopad infekce SARS-CoV-2. N. Eng. J. Medicine. 383 (6), E38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI falešně pozitivní a falešně negativní případy Covid-19: Strategie prevence a řízení dýchacích cest, očkování a další perspektivy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI falešně pozitivní a falešně negativní případy Covid-19: Strategie prevence a řízení dýchacích cest, očkování a další perspektivy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, Ki ложноположительные и ложноотрицательные с oběžné kovid-19: респ dovolek с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с с респ dovolek вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falešně pozitivní a falešně negativní případy CoVID-19: Strategie prevence a léčby dýchacích cest, očkování a cesta vpřed.Muliu, DS a Gurgulianis, KI falešně pozitivní a falešně negativní případy CoVID-19: Strategie pro prevenci a léčbu respirační, očkování a cesta vpřed. Expert Ctihodný respire. lék. 15 (8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19 Diagnóza na pohotovostním oddělení: vidět strom, ale ztrácí les. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19 Diagnóza na pohotovostním oddělení: vidět strom, ale ztrácí les.Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Covid-19 Diagnóza na pohotovostním oddělení: viz strom, ztratíte les.Muliou DS, Ioannis P. a Konstantinos G. Covid-19 Diagnóza v pohotovostních místnostech: Nedostatek lesa pro stromy. Objevit se. lék. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. a kol. Validace a validace analytického a klinického výkonu testu Abbott v reálném čase SARS-CoV-2. J. Klinická. Virus. 129, 104474. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnání pět sad primerů z různých genomových oblastí Covid-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnání pěti sad primerů z různých genomových oblastí Covid-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatunyan, B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu Covid-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自 Covid-19 ， ， 用于通过常规 用于通过常规 rt-pcr 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnání 5 různých genetických oblastí CoVID-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. a Aflatunyan B. Porovnání pěti sad primerů z různých oblastí genomu Covid-19 pro detekci virové infekce konvenční RT-PCR.Írán. J. Mikrobiologie. 12 (3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Předběžné výsledky národního programu hodnocení vnější kvality pro detekci genomových sekvencí SARS-CoV-2. J. Klinická. Virus. 129, 104537. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. a kol. Analytické hodnocení účinnosti pěti souprav RT-PCR pro závažný akutní respirační syndrom koronavirus 2. J. Clinical. laboratoř. anus. 35 (1), E23643 (2021).
Wang B. et al. Vyhodnocení sedmi komerčně dostupných sad detekčních sad SARS-CoV-2 RNA v Číně na základě polymerázové řetězové reakce v reálném čase (PCR). klinický. Chemikálie. laboratoř. lék. 58 (9), E149 - E153 (2020).
Van Casteren, PB et al. Porovnání sedmi komerčních diagnostických souprav RT-PCR Covid-19. J. Klinická. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Porovnání diagnostického výkonu dvou souprav PCR pro detekci nukleových kyselin SARS-CoV-2. J. Klinická. laboratoř. anus. 34 (10), E23554 (2020).
Lefart, PR atd. Srovnávací studie čtyř platforem amplifikačních amplifikačních amplifikačních testování nukleových kyselin SARS-CoV-2 (NAAT) ukázala, že výkon ID byl nyní významně degradován v závislosti na typu pacienta a vzorku. diagnóza. mikrobiologie. Infikovat. diss. 99 (1), 115200 (2021).
Abbott molekula. Abbott v reálném čase SARS-CoV-2 Analysis Balíček vložení. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/realtime-sars-cov-2-asy. 1-12. (Od 10. srpna 2020) (2020).
Klein, S. a kol. Izolace RNA SARS-CoV-2 pomocí magnetických kuliček pro rychlou rozsáhlou detekci pomocí RT-qPCR a RT-lamp. Virus 12 (8), 863 (2020).