Interferenční faktory v PCR reakcích

Během PCR reakce se často setkáváme s některými rušivými faktory.
Vzhledem k velmi vysoké citlivosti PCR je kontaminace považována za jeden z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících výsledky PCR a může vést k falešně pozitivním výsledkům.
Stejně důležité jsou různé zdroje, které vedou k falešně negativním výsledkům. Pokud je jedna nebo více základních částí PCR směsi nebo samotná amplifikační reakce inhibována nebo narušena, může být diagnostický test omezen. To může vést ke snížené účinnosti a dokonce i k falešně negativním výsledkům.
Kromě inhibice může dojít ke ztrátě integrity cílové nukleové kyseliny v důsledku přepravních a/nebo skladovacích podmínek před přípravou vzorku. Zejména vysoké teploty nebo nedostatečné skladování mohou vést k poškození buněk a nukleových kyselin. Fixace buněk a tkání a zalévání do parafínu jsou dobře známými příčinami fragmentace DNA a přetrvávajícím problémem (viz obrázky 1 a 2). V těchto případech nepomůže ani optimální izolace a purifikace.

Obrázek 1 | Vliv imobilizace na integritu DNA
Elektroforéza na agarózovém gelu ukázala, že kvalita DNA izolované z parafínových řezů pitev se značně lišila. V extraktech byla přítomna DNA s různou průměrnou délkou fragmentů v závislosti na metodě fixace. DNA byla konzervována pouze při fixaci v nativních zmrazených vzorcích a v pufrovaném neutrálním formalínu. Použití silně kyselého Bouinového fixativu nebo nepufrovaného formalínu obsahujícího kyselinu mravenčí vedlo k významné ztrátě DNA. Zbývající frakce je vysoce fragmentovaná.
Vlevo je délka fragmentů vyjádřena v kilobázových párech (kbp)

Obrázek 2 | Ztráta integrity cílových nukleových kyselin
(a) Mezera 3′-5′ na obou řetězcích povede k přerušení cílové DNA. Syntéza DNA bude i na malém fragmentu probíhat. Pokud však na fragmentu DNA chybí místo pro navázání primerů, dochází pouze k lineární amplifikaci. V nejpříznivějším případě se fragmenty mohou vzájemně resaturovat, ale výtěžky budou malé a pod detekčními limity.
(b) Ztráta bází, zejména v důsledku depurinace a tvorby thymidinových dimeru, vede ke snížení počtu vodíkových vazeb a poklesu Tm. Během prodloužené fáze ohřevu se primery odtají z matricové DNA a nebudou se navazovat ani za méně přísných podmínek.
(c) Sousední thyminové báze tvoří TT dimer.
Dalším častým problémem, který se v molekulární diagnostice často vyskytuje, je méně než optimální uvolňování cílových nukleových kyselin ve srovnání s fenol-chloroformovou extrakcí. V extrémních případech to může být spojeno s falešně negativními výsledky. Lýza varem nebo enzymatickým štěpením buněčných zbytků lze ušetřit mnoho času, ale tato metoda často vede k nízké citlivosti PCR kvůli nedostatečnému uvolnění nukleových kyselin.

Inhibice polymerázové aktivity během amplifikace

Inhibice se obecně používá jako kontejnerový koncept k popisu všech faktorů, které vedou k suboptimálním výsledkům PCR. V striktně biochemickém smyslu je inhibice omezena na aktivitu enzymu, tj. snižuje nebo zabraňuje konverzi substrát-produkt interakcí s aktivním místem DNA polymerázy nebo jejím kofaktorem (např. Mg2+ pro Taq DNA polymerázu).
Složky ve vzorku nebo různé pufry a extrakty obsahující činidla mohou přímo inhibovat enzym nebo zachytit jeho kofaktory (např. EDTA), čímž inaktivují polymerázu a následně vedou ke sníženým nebo falešně negativním výsledkům PCR.
Mnoho interakcí mezi reakčními složkami a nukleovými kyselinami obsahujícími cíl je však také označováno jako „inhibitory PCR“. Jakmile je integrita buňky narušena izolací a nukleová kyselina je uvolněna, může dojít k interakcím mezi vzorkem a okolním roztokem a pevnou fází. Například „lapače“ mohou vázat jednovláknovou nebo dvouvláknovou DNA prostřednictvím nekovalentních interakcí a interferovat s izolací a purifikaci snížením počtu cílů, které se nakonec dostanou do reakční nádoby PCR.
Inhibitory PCR jsou obecně přítomny ve většině tělních tekutin a činidel používaných pro klinické diagnostické testy (močovina v moči, hemoglobin a heparin v krvi), doplňcích stravy (organické složky, glykogen, tuk, ionty Ca2+) a složkách životního prostředí (fenoly, těžké kovy).

Více rozšířených inhibitorů PCR lze nalézt v bakteriích a eukaryotických buňkách, necílové DNA, makromolekulách vázajících DNA v tkáňových matricích a laboratorním vybavení, jako jsou rukavice a plasty. Purifikace nukleových kyselin během extrakce nebo po ní je preferovanou metodou pro odstranění inhibitorů PCR.
Dnes mohou různá automatizovaná extrakční zařízení nahradit mnoho manuálních protokolů, ale 100% výtěžnost a/nebo purifikace cílů nebyla nikdy dosažena. Potenciální inhibitory mohou být stále přítomny v purifikovaných nukleových kyselinách nebo již mohly začít účinkovat. Existují různé strategie pro snížení dopadu inhibitorů. Volba vhodné polymerázy může mít významný vliv na aktivitu inhibitoru. Dalšími osvědčenými metodami pro snížení inhibice PCR jsou zvýšení koncentrace polymerázy nebo aplikace aditiv, jako je BSA.
Inhibici PCR reakcí lze prokázat pomocí interní kontroly kvality procesu (IPC).
Je třeba dbát na to, aby byly z izolátu nukleové kyseliny důkladným promytím odstraněny všechny reagencie a další roztoky v extrakční soupravě, jako je ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol a fenol. V závislosti na jejich koncentraci mohou aktivovat nebo inhibovat PCR.