Interferenční faktory v PCR reakcích

Během reakce PCR se často setkávají s některými interferujícími faktory.
Kvůli velmi vysoké citlivosti PCR je kontaminace považována za jeden z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících výsledky PCR a může přinést falešně pozitivní výsledky.
Stejně kritické jsou různé zdroje, které vedou k falešně negativním výsledkům. Pokud jsou inhibovány nebo narušeny jedné nebo více nezbytných částí směsi PCR nebo samotné amplifikační reakce, lze bránit diagnostickému testu. To může vést ke snížení účinnosti a dokonce k falešným negativním výsledkům.
Kromě inhibice může dojít ke ztrátě cílové integrity nukleové kyseliny v důsledku přepravních a/nebo skladovacích podmínek před přípravou vzorku. Zejména vysoké teploty nebo nedostatečné skladování mohou vést k poškození buněk a nukleových kyselin. Fixace buněk a tkáně a vložení parafinu jsou dobře známými příčinami fragmentace DNA a přetrvávajícího problému (viz obrázky 1 a 2). V těchto případech ani optimální izolace a čištění nepomůže.

Obrázek 1 | Vliv imobilizace na integritu DNA
Agarózová gelová elektroforéza ukázala, že kvalita DNA izolované z parafinových řezů pitev se výrazně lišila. DNA různých průměrných délek fragmentu byla přítomna v extraktech v závislosti na fixační metodě. DNA byla zachována pouze tehdy, když byla fixována v nativních zmrazených vzorcích a v pufrovaném neutrálním formalinu. Použití silně kyselého fixačního nebo bezútěšného formalinu obsahujícího kyselinu mravenčí vedlo k významné ztrátě DNA. Zbývající frakce je vysoce roztříštěná.
Vlevo je délka fragmentů vyjádřena v párech Kilobase (KBP)

Obrázek 2 | Ztráta integrity cílů nukleových kyselin
(A) Mezera 3'-5 'na obou pramenech povede k přerušení cílové DNA. Syntéza DNA se stále vyskytuje na malém fragmentu. Pokud však na fragmentu DNA chybí místo žíhání primeru, dochází k pouze lineární amplifikaci. V nejvýhodnějším případě se mohou fragmenty navzájem opírovat, ale výnosy budou malé a pod úrovní detekce.
(b) Ztráta bází, zejména v důsledku depurinace a tvorby dimeru thymidinu, vede ke snížení počtu H-vazeb a snížení TM. Během fáze prodlouženého oteplování se primery roztaví od maticové DNA a nebudou žíhat ani za méně přísných podmínek.
(c) Přilehlé thyminové báze tvoří dimer TT.
Dalším běžným problémem, který se často vyskytuje v molekulární diagnostice, je méně než optimální uvolňování cílových nukleových kyselin ve srovnání s extrakcí fenol-chloroform. V extrémních případech to může být spojeno s falešnými negativy. Mnoho času lze zachránit vařením lýzy nebo enzymatického trávení buněčných zbytků, ale tato metoda často vede k nízké citlivosti PCR v důsledku nedostatečného uvolňování nukleové kyseliny.

Inhibice polymerázové aktivity během amplifikace

Obecně se inhibice používá jako koncept kontejneru k popisu všech faktorů, které vedou k suboptimálním výsledkům PCR. V přísně biochemickém smyslu je inhibice omezena na aktivitu enzymu, tj. Snižuje nebo zabraňuje přeměně substrátového produktu interakcí s aktivním místem DNA polymerázy nebo jeho kofaktorem (např. MG2+ pro polymerázu TAQ DNA).
Složky ve vzorku nebo různých pufru a extraktech obsahujících činidla mohou přímo inhibovat enzym nebo zachytit jeho kofaktory (např. EDTA), čímž inaktivují polymerázu a zase vede ke snížení nebo falešným negativním výsledkům PCR.
Mnoho interakcí mezi reakčními složkami a nukleovými kyselinami obsahujícími cíl je však také označeno jako „inhibitory PCR“. Jakmile je integrita buňky narušena izolací a uvolňuje se nukleová kyselina, může dojít k interakcím mezi vzorkem a jeho okolním roztokem a pevnou fází. Například „Scavengers“ mohou vázat jedno- nebo dvouřetězcovou DNA prostřednictvím neavalentních interakcí a narušit izolaci a čištění snížením počtu cílů, které nakonec dosáhnou reakční nádoby PCR.
Obecně jsou inhibitory PCR přítomny ve většině tělesných tekutin a činidel používaných pro klinické diagnostické testy (močovina v moči, hemoglobin a heparin v krvi), doplňky stravy (organické složky, glykogen, tuk, ionty Ca2+) a složky v prostředí (fenoly, těžké metaly) (fenoly, těžké metaly)

Převládající inhibitory PCR lze nalézt v bakteriích a eukaryotických buňkách, necílových DNA, makromolekulách vázajících se na DNA tkáňových matric a laboratorních zařízení, jako jsou rukavice a plasty. Čištění nukleových kyselin během nebo po extrakci je preferovaná metoda pro odstranění inhibitorů PCR.
Dnes může různá automatizovaná extrakční zařízení nahradit mnoho manuálních protokolů, ale 100% zotavení a/nebo čištění cílů nebylo nikdy dosaženo. Potenciální inhibitory mohou být stále přítomny v purifikovaných nukleových kyselinách nebo se již mohou projevit. Existují různé strategie pro snížení dopadu inhibitorů. Volba vhodné polymerázy může mít významný dopad na aktivitu inhibitoru. Dalšími prokázanými metodami ke snížení inhibice PCR jsou zvýšení koncentrace polymerázy nebo použití aditiv, jako je BSA.
Inhibice reakcí PCR může být prokázána použitím interní kontroly kvality procesu (IPC).
Je třeba dbát na to, aby se odstranila všechna činidla a další roztoky v extrakční soupravě, jako jsou ethanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, Isopropanol a fenol, z izolátu nukleové kyseliny důkladným krokem promývání. V závislosti na jejich koncentraci mohou aktivovat nebo inhibovat PCR.