Interferenční faktory v PCR reakcích

Během PCR reakce se často setkáváme s některými interferujícími faktory.
Vzhledem k velmi vysoké citlivosti PCR je kontaminace považována za jeden z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících výsledky PCR a může vést k falešně pozitivním výsledkům.
Stejně kritické jsou různé zdroje, které vedou k falešně negativním výsledkům. Pokud je jedna nebo více základních částí směsi PCR nebo samotná amplifikační reakce inhibována nebo interferována, diagnostický test může být znemožněn. To může vést ke snížení účinnosti a dokonce falešně negativním výsledkům.
Kromě inhibice může dojít ke ztrátě integrity cílové nukleové kyseliny v důsledku přepravních a/nebo skladovacích podmínek před přípravou vzorku. Zejména vysoké teploty nebo nevhodné skladování mohou vést k poškození buněk a nukleových kyselin. Fixace buněk a tkání a zalití parafínem jsou dobře známé příčiny fragmentace DNA a přetrvávající problém (viz obrázky 1 a 2). V těchto případech nepomůže ani optimální izolace a čištění.

Obrázek 1 | Vliv imobilizace na integritu DNA
Elektroforéza na agarózovém gelu ukázala, že kvalita DNA izolované z parafinových řezů pitev se značně lišila. V extraktech byla přítomna DNA různých průměrných délek fragmentů v závislosti na způsobu fixace. DNA byla zachována pouze při fixaci v nativních zmrazených vzorcích a v pufrovaném neutrálním formalínu. Použití silně kyselého Bouin fixativa nebo nepufrovaného formalínu obsahujícího kyselinu mravenčí vedlo k významné ztrátě DNA. Zbývající frakce je vysoce fragmentovaná.
Vlevo je délka fragmentů vyjádřena v párech kilobází (kbp)

Obrázek 2 | Ztráta integrity cílů nukleové kyseliny
(a) Mezera 3′-5′ na obou vláknech bude mít za následek zlom v cílové DNA. syntéza DNA bude stále probíhat na malém fragmentu. Pokud však na fragmentu DNA chybí místo nasedání primeru, dochází pouze k lineární amplifikaci. V nejpříznivějším případě se fragmenty mohou navzájem znovu nasytit, ale výtěžky budou malé a pod úrovní detekce.
(b) Ztráta bází, zejména v důsledku depurinace a tvorby thymidinového dimeru, vede ke snížení počtu H-vazeb a snížení Tm. Během prodloužené ohřívací fáze se primery roztaví od matricové DNA a nebudou se žíhat ani za méně přísných podmínek.
(c) Sousední thyminové báze tvoří TT dimer.
Dalším běžným problémem, který se často vyskytuje v molekulární diagnostice, je méně než optimální uvolňování cílových nukleových kyselin ve srovnání s extrakcí fenol-chloroformem. V extrémních případech to může být spojeno s falešnými negativy. Mnoho času lze ušetřit varem lýzy nebo enzymatickým štěpením buněčných zbytků, ale tato metoda často vede k nízké citlivosti PCR kvůli nedostatečnému uvolňování nukleové kyseliny.

Inhibice aktivity polymerázy během amplifikace

Obecně se inhibice používá jako kontejnerový koncept k popisu všech faktorů, které vedou k suboptimálním výsledkům PCR. V přísně biochemickém smyslu je inhibice omezena na aktivitu enzymu, tj. snižuje nebo zabraňuje konverzi substrát-produkt prostřednictvím interakce s aktivním místem DNA polymerázy nebo jejího kofaktoru (např. Mg2+ pro Taq DNA polymerázu).
Komponenty ve vzorku nebo různé pufry a extrakty obsahující činidla mohou přímo inhibovat enzym nebo zachytit jeho kofaktory (např. EDTA), čímž inaktivují polymerázu a následně to vede ke snížení nebo falešně negativním výsledkům PCR.
Nicméně, mnoho interakcí mezi reakčními složkami a cíl obsahujícími nukleovými kyselinami je také označováno jako 'PCR inhibitory'. Jakmile je integrita buňky narušena izolací a nukleová kyselina je uvolněna, může dojít k interakcím mezi vzorkem a okolním roztokem a pevnou fází. Například „scavengery“ mohou vázat jednovláknovou nebo dvouvláknovou DNA prostřednictvím nekovalentních interakcí a interferovat s izolací a purifikací snížením počtu cílů, které nakonec dosáhnou reakční nádoby PCR.
Obecně platí, že inhibitory PCR jsou přítomny ve většině tělesných tekutin a činidel používaných pro klinické diagnostické testy (močovina v moči, hemoglobin a heparin v krvi), potravinových doplňcích (organické složky, glykogen, tuk, ionty Ca2+) a složkách životního prostředí (fenoly, těžké kovy)

Více rozšířené inhibitory PCR lze nalézt v bakteriích a eukaryotických buňkách, necílové DNA, DNA-vazebných makromolekulách tkáňových matric a laboratorních zařízeních, jako jsou rukavice a plasty. Purifikace nukleových kyselin během nebo po extrakci je preferovanou metodou pro odstranění inhibitorů PCR.
Různá automatizovaná extrakční zařízení dnes mohou nahradit mnoho manuálních protokolů, ale 100% regenerace a/nebo čištění cílů nebylo nikdy dosaženo. Potenciální inhibitory mohou být stále přítomny v purifikovaných nukleových kyselinách nebo mohou již působit. Existují různé strategie pro snížení účinku inhibitorů. Výběr vhodné polymerázy může mít významný dopad na aktivitu inhibitoru. Další osvědčené metody pro snížení inhibice PCR jsou zvýšení koncentrace polymerázy nebo aplikace přísad, jako je BSA.
Inhibici reakcí PCR lze prokázat použitím interní kontroly kvality procesu (IPC).
Je třeba dbát na odstranění všech činidel a dalších roztoků v extrakční soupravě, jako je ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol a fenol, z izolátu nukleové kyseliny důkladným promytím. V závislosti na jejich koncentraci mohou aktivovat nebo inhibovat PCR.