Testování metylace DNA v kombinaci s chytrými telefony pro časný screening nádorů a screening leukémie s přesností 90,0 %!

Včasná detekce rakoviny na základě tekuté biopsie je nový směr detekce a diagnostiky rakoviny navržený v posledních letech americkým National Cancer Institute s cílem odhalit časnou rakovinu nebo dokonce prekancerózní léze. Je široce používán jako nový biomarker pro časnou diagnostiku různých malignit, včetně rakoviny plic, gastrointestinálních nádorů, gliomů a gynekologických nádorů.

Vznik platforem pro identifikaci biomarkerů methylační krajiny (Methylscape) má potenciál výrazně zlepšit stávající časný screening rakoviny a uvést pacienty do nejčasnější léčitelné fáze.

Nedávno výzkumníci vyvinuli jednoduchou a přímou snímací platformu pro detekci metylační krajiny založenou na cysteaminem zdobených zlatých nanočásticích (Cyst/AuNPs) v kombinaci s biosenzorem založeným na smartphonu, který umožňuje rychlý časný screening široké škály nádorů. Včasný screening na leukémii lze provést do 15 minut po extrakci DNA ze vzorku krve s přesností 90,0 %. Název článku je Rychlá detekce rakovinné DNA v lidské krvi pomocí AuNP s cysteaminem a chytrého telefonu s podporou strojového učení.

Obrázek 1. Jednoduchá a rychlá snímací platforma pro screening rakoviny prostřednictvím komponent Cyst/AuNPs může být provedena ve dvou jednoduchých krocích.

To je znázorněno na obrázku 1. Nejprve byl k rozpuštění fragmentů DNA použit vodný roztok. Cysta/AuNP byly poté přidány do smíšeného roztoku. Normální a maligní DNA mají různé methylační vlastnosti, což má za následek fragmenty DNA s různými vzory samosestavení. Normální DNA agreguje volně a nakonec agreguje Cyst/AuNP, což má za následek červenou posunutou povahu Cyst/AuNP, takže změnu barvy z červené na fialovou lze pozorovat pouhým okem. Naproti tomu jedinečný metylační profil rakovinné DNA vede k produkci větších shluků fragmentů DNA.

Snímky 96jamkových destiček byly pořízeny pomocí fotoaparátu smartphonu. DNA rakoviny byla měřena smartphonem vybaveným strojovým učením ve srovnání s metodami založenými na spektroskopii.

Screening rakoviny ve skutečných krevních vzorcích

Aby se rozšířila užitečnost snímací platformy, vědci použili senzor, který úspěšně rozlišoval mezi normální a rakovinnou DNA ve skutečných krevních vzorcích. methylační vzory v místech CpG epigeneticky regulují genovou expresi. Téměř u všech typů rakoviny bylo pozorováno střídání změn v methylaci DNA a tím i v expresi genů, které podporují tumorigenezi.

Jako model pro další druhy rakoviny spojené s metylací DNA použili vědci vzorky krve od pacientů s leukémií a zdravých kontrol, aby prozkoumali účinnost metylační krajiny při odlišení leukemických rakovin. Tento biomarker methylační krajiny nejenže překonává stávající metody rychlého screeningu leukémie, ale také demonstruje proveditelnost rozšíření na včasnou detekci široké škály rakovin pomocí tohoto jednoduchého a přímočarého testu.

Byla analyzována DNA ze vzorků krve od 31 pacientů s leukémií a 12 zdravých jedinců. jak je ukázáno v krabicovém grafu na obrázku 2a, relativní absorbance vzorků rakoviny (AA650/525) byla nižší než u DNA z normálních vzorků. bylo to způsobeno především zvýšenou hydrofobicitou vedoucí k husté agregaci rakovinné DNA, která zabránila agregaci Cyst/AuNP. V důsledku toho byly tyto nanočástice zcela rozptýleny ve vnějších vrstvách rakovinných agregátů, což vedlo k odlišné disperzi Cyst/AuNP adsorbovaných na normálních a rakovinných agregátech DNA. Křivky ROC pak byly generovány změnou prahové hodnoty od minimální hodnoty AA650/525 po maximální hodnotu.

Obrázek 2.(a) Hodnoty relativní absorbance roztoků cyst/AuNP ukazující přítomnost normální (modré) a rakovinné (červené) DNA za optimalizovaných podmínek

(DA650/525) krabicových parcel; (b) ROC analýza a vyhodnocení diagnostických testů. c) Matice zmatení pro diagnostiku normálních pacientů a pacientů s rakovinou. (d) Senzitivita, specificita, pozitivní prediktivní hodnota (PPV), negativní prediktivní hodnota (NPV) a přesnost vyvinuté metody.

Jak je znázorněno na obrázku 2b, plocha pod ROC křivkou (AUC = 0,9274) získaná pro vyvinutý senzor vykazovala vysokou citlivost a specificitu. Jak je vidět z krabicového grafu, nejnižší bod představující skupinu normální DNA není dobře oddělen od nejvyššího bodu představujícího skupinu DNA rakoviny; proto byla k rozlišení mezi normální a rakovinnou skupinou použita logistická regrese. Vzhledem k souboru nezávislých proměnných odhaduje pravděpodobnost výskytu události, jako je rakovina nebo normální skupina. Závislá proměnná se pohybuje mezi 0 a 1. Výsledkem je tedy pravděpodobnost. Stanovili jsme pravděpodobnost identifikace rakoviny (P) na základě AA650/525 následovně.

kde b=5,3533,wl=-6,965. Pro klasifikaci vzorků pravděpodobnost menší než 0,5 znamená normální vzorek, zatímco pravděpodobnost 0,5 nebo vyšší znamená vzorek rakoviny. Obrázek 2c znázorňuje matoucí matici vygenerovanou z křížové validace ponechání samostatně, která byla použita k ověření stability klasifikační metody. Obrázek 2d shrnuje vyhodnocení diagnostického testu metody, včetně senzitivity, specificity, pozitivní prediktivní hodnoty (PPV) a negativní prediktivní hodnoty (NPV).

Biosenzory založené na smartphonu

Pro další zjednodušení testování vzorků bez použití spektrofotometrů použili vědci umělou inteligenci (AI) k interpretaci barvy roztoku a rozlišení mezi normálními a rakovinnými jedinci. Vzhledem k tomu bylo použito počítačové vidění k převodu barvy roztoku Cyst/AuNPs do normální DNA (fialová) nebo rakovinové DNA (červená) pomocí snímků 96jamkových destiček pořízených fotoaparátem mobilního telefonu. Umělá inteligence může snížit náklady a zlepšit dostupnost při interpretaci barev nanočásticových řešení, a to bez použití jakéhokoli optického hardwarového příslušenství smartphonu. Nakonec byly pro konstrukci modelů vyškoleny dva modely strojového učení, včetně Random Forest (RF) a Support Vector Machine (SVM). oba modely RF i SVM správně klasifikovaly vzorky jako pozitivní a negativní s přesností 90,0 %. To naznačuje, že použití umělé inteligence v biosensingu založeném na mobilních telefonech je docela možné.

Obrázek 3.(a) Cílová třída roztoku zaznamenaná během přípravy vzorku pro krok pořízení snímku. (b) Ukázkový snímek pořízený během kroku pořízení snímku. (c) Intenzita barvy roztoku cyst/AuNP v každé jamce 96jamkové destičky extrahované ze snímku (b).

Pomocí Cyst/AuNP výzkumníci úspěšně vyvinuli jednoduchou snímací platformu pro detekci methylační krajiny a senzor schopný rozlišit normální DNA od rakovinové DNA při použití skutečných krevních vzorků pro screening leukémie. Vyvinutý senzor prokázal, že DNA extrahovaná ze skutečných krevních vzorků byla schopna rychle a levně detekovat malá množství rakovinné DNA (3 nM) u pacientů s leukémií za 15 minut a prokázala přesnost 95,3 %. Pro další zjednodušení testování vzorků odstraněním potřeby spektrofotometru bylo použito strojové učení k interpretaci barvy roztoku a rozlišení mezi normálními a rakovinnými jedinci pomocí fotografie z mobilního telefonu, přičemž bylo také možné dosáhnout přesnosti 90,0 %.

Reference: DOI: 10.1039/d2ra05725e