Testování metylace DNA v kombinaci s chytrými telefony pro včasný screening nádorů a leukémie s přesností 90,0 %!

Včasná detekce rakoviny na základě tekuté biopsie je nový směr detekce a diagnostiky rakoviny, který v posledních letech navrhl americký Národní onkologický institut s cílem odhalit časné stádium rakoviny nebo dokonce prekancerózní léze. Široce se používá jako nový biomarker pro včasnou diagnostiku různých malignit, včetně rakoviny plic, gastrointestinálních nádorů, gliomů a gynekologických nádorů.

Vznik platforem pro identifikaci biomarkerů methylační krajiny (Methylscape) má potenciál významně zlepšit stávající včasný screening rakoviny a umístit pacienty do nejranějšího léčitelného stádia.

Nedávno vědci vyvinuli jednoduchou a přímočarou platformu pro detekci methylační krajiny založenou na zlatých nanočásticích dekorovaných cysteaminem (Cyst/AuNP) v kombinaci s biosenzorem na bázi chytrého telefonu, která umožňuje rychlý včasný screening široké škály nádorů. Včasný screening leukémie lze provést do 15 minut po extrakci DNA ze vzorku krve s přesností 90,0 %. Název článku: Rychlá detekce rakovinné DNA v lidské krvi za použití AuNP s cysteaminem a chytrého telefonu s podporou strojového učení.

Obrázek 1. Jednoduchá a rychlá snímací platforma pro screening rakoviny pomocí komponent Cyst/AuNPs může být realizována ve dvou jednoduchých krocích.

Toto je znázorněno na obrázku 1. Nejprve byl k rozpuštění fragmentů DNA použit vodný roztok. Do směsi byly poté přidány Cyst/AuNP. Normální a maligní DNA mají odlišné metylační vlastnosti, což vede k fragmentům DNA s různými vzory samouspořádání. Normální DNA se volně agreguje a nakonec agreguje Cyst/AuNP, což má za následek červený posun v povaze Cyst/AuNP, takže změnu barvy z červené na fialovou lze pozorovat pouhým okem. Naproti tomu jedinečný metylační profil rakovinné DNA vede k produkci větších shluků fragmentů DNA.

Snímky 96jamkových destiček byly pořízeny pomocí fotoaparátu chytrého telefonu. Rakovinná DNA byla měřena chytrým telefonem vybaveným strojovým učením ve srovnání s metodami založenými na spektroskopii.

Screening rakoviny ve vzorcích skutečné krve

Aby se rozšířila užitečnost senzorické platformy, vědci použili senzor, který úspěšně rozlišoval mezi normální a rakovinnou DNA ve vzorcích reálné krve. Metylační vzorce v místech CpG epigeneticky regulují genovou expresi. U téměř všech typů rakoviny byly pozorovány střídavé změny v metylaci DNA, a tedy i v expresi genů, které podporují tumorigenezi.

Jako model pro další druhy rakoviny spojené s metylací DNA použili vědci vzorky krve od pacientů s leukémií a zdravých kontrolních osob k prozkoumání účinnosti metylační krajiny v diferenciaci leukemických karcinomů. Tento biomarker metylační krajiny nejen překonává stávající metody rychlého screeningu leukémie, ale také demonstruje proveditelnost rozšíření na včasnou detekci široké škály rakovin pomocí tohoto jednoduchého a přímočarého testu.

Byla analyzována DNA z krevních vzorků od 31 pacientů s leukémií a 12 zdravých jedinců. Jak je znázorněno v rámečkovém grafu na obrázku 2a, relativní absorbance vzorků rakoviny (ΔA650/525) byla nižší než u DNA z normálních vzorků. To bylo způsobeno především zvýšenou hydrofobicitou, která vedla k husté agregaci rakovinné DNA, jež zabránila agregaci Cyst/AuNP. V důsledku toho byly tyto nanočástice zcela dispergovány ve vnějších vrstvách rakovinných agregátů, což vedlo k odlišné disperzi Cyst/AuNP adsorbovaných na normálních a rakovinných agregátech DNA. ROC křivky byly poté generovány změnou prahové hodnoty od minimální hodnoty ΔA650/525 do maximální hodnoty.

Obrázek 2.(a) Relativní hodnoty absorbance roztoků cyst/AuNP ukazující přítomnost normální (modře) a rakovinné (červeně) DNA za optimalizovaných podmínek

(DA650/525) krabicových grafů; (b) ROC analýza a vyhodnocení diagnostických testů. (c) Matice zmatků pro diagnózu normálních a onkologických pacientů. (d) Citlivost, specificita, pozitivní prediktivní hodnota (PPV), negativní prediktivní hodnota (NPV) a přesnost vyvinuté metody.

Jak je znázorněno na obrázku 2b, plocha pod ROC křivkou (AUC = 0,9274) získaná pro vyvinutý senzor vykazovala vysokou citlivost a specificitu. Jak je patrné z krabicového grafu, nejnižší bod představující normální skupinu DNA není dobře oddělen od nejvyššího bodu představujícího skupinu rakovinné DNA; proto byla k rozlišení mezi normální a rakovinnou skupinou použita logistická regrese. Na základě sady nezávislých proměnných odhaduje pravděpodobnost výskytu události, jako je rakovinná nebo normální skupina. Závislá proměnná se pohybuje mezi 0 a 1. Výsledkem je tedy pravděpodobnost. Pravděpodobnost identifikace rakoviny (P) jsme stanovili na základě ΔA650/525 následovně.

kde b=5,3533,w1=-6,965. Pro klasifikaci vzorku pravděpodobnost menší než 0,5 indikuje normální vzorek, zatímco pravděpodobnost 0,5 nebo vyšší indikuje vzorek s rakovinou. Obrázek 2c znázorňuje matici zmatku generovanou křížovou validací metody „leave-it-alone“, která byla použita k ověření stability klasifikační metody. Obrázek 2d shrnuje hodnocení diagnostických testů metody, včetně citlivosti, specificity, pozitivní prediktivní hodnoty (PPV) a negativní prediktivní hodnoty (NPV).

Biosenzory založené na chytrých telefonech

Pro další zjednodušení testování vzorků bez použití spektrofotometrů vědci použili umělou inteligenci (AI) k interpretaci barvy roztoku a rozlišení mezi normálními a rakovinnými jedinci. Vzhledem k tomu bylo použito počítačové vidění k překladu barvy roztoku Cyst/AuNPs na normální DNA (fialová) nebo rakovinnou DNA (červená) s využitím snímků 96jamkových destiček pořízených fotoaparátem mobilního telefonu. Umělá inteligence může snížit náklady a zlepšit dostupnost interpretace barvy roztoků nanočástic, a to bez použití jakéhokoli optického hardwarového příslušenství smartphonu. Nakonec byly pro konstrukci modelů natrénovány dva modely strojového učení, včetně Random Forest (RF) a Support Vector Machine (SVM). Oba modely, RF i SVM, správně klasifikovaly vzorky jako pozitivní a negativní s přesností 90,0 %. To naznačuje, že využití umělé inteligence v biosenzorech založených na mobilních telefonech je docela možné.

Obrázek 3.(a) Cílová třída roztoku zaznamenaná během přípravy vzorku pro krok pořízení obrazu. (b) Příklad obrazu pořízeného během kroku pořízení obrazu. (c) Intenzita barvy roztoku cyst/AuNPs v každé jamce 96jamkové destičky extrahované ze obrazu (b).

Vědci s využitím Cyst/AuNP úspěšně vyvinuli jednoduchou senzorickou platformu pro detekci methylační krajiny a senzor schopný rozlišit normální DNA od rakovinné DNA při použití skutečných vzorků krve pro screening leukémie. Vyvinutý senzor prokázal, že DNA extrahovaná ze skutečných vzorků krve byla schopna rychle a nákladově efektivně detekovat malé množství rakovinné DNA (3 nM) u pacientů s leukémií během 15 minut s přesností 95,3 %. Pro další zjednodušení testování vzorků eliminací potřeby spektrofotometru bylo použito strojové učení k interpretaci barvy roztoku a rozlišení mezi normálními a rakovinnými jedinci pomocí fotografie z mobilního telefonu s přesností 90,0 %.

Reference: DOI: 10.1039/d2ra05725e